试剂

 

包被液（P H9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

 

磷酸盐缓冲液（p H 7 . 4 )称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至500ml, 121°C灭菌15分钟。

 

洗涤液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。

 

稀释液（p H 7 . 4 )称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。

 

浓稀释液称取牛血清白蛋白l.O g , 加洗涤液溶解并稀释至100ml。

 

底物缓冲液（pH 5 .0枸橼酸-磷酸盐缓冲液） 称取磷酸氢二钠（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸橼酸 0. 51g，加水溶解并稀释至100ml。

 

底物液取邻苯二胺8mg、30%过氧化氢30^1，溶于底物缓冲液20ml中。临用时现配。

 

终止液lm o l/L硫酸溶液。标准品溶液的制备按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每lm l中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。

 

供试品溶液的制备

 

取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中约含250μg的溶液。如供试品每lml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释1倍。

 

测定法

 

取兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体适量，用包被液溶解并稀释成每lml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至9 6孔酶标板内，4放置过夜（16?18小时）。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，37放置2 小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3 次；以100μl/孔加人标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2 孔空白对照（稀释液），37°C放置2 小时；用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白质抗体1000倍，以100μl/ 孔加至酶标板内，37°C放置1 小时，用洗涤液洗板1 0次，以lOOμl/孔加人底物液，3 7 避光放置4 0 分钟，以5 0 μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长4 9 2 n m 处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。

 

以标准品溶液吸光度对其相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到相应菌体蛋白质含量，

 

按以下公式计算：

 

供试品菌体蛋白质残留量（％) = （c×n）/（T×106）×100

 

式中  c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng/ml;

 

      n为供试品稀释倍数；

 

      T为供试品蛋白质含量，mg/ml。

 

注：也可采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。