SDS-PAGE测定蛋白质分子量及多酚氧化酶的纯度鉴定

一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺 凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、仪器与试剂

1、材料：

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析 的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。

2、试剂：

(1)丙稀酰胺(Acr母液)：30%Acr (Acr/Bis)

(2)10%的SDS溶液

(3)10%的过硫酸铵溶液

(4)四甲基乙二胺(TEMED)

(5)分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8

(6)浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8

(7)电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3

(8)样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰

(9)染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液

(10)脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液

(11)标准分子量蛋白。

3、仪器设备：

电泳仪、垂直电泳槽等。

三、操作步骤

1、凝胶制备：

用两块电泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏胶)，垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

2、上样：

分别取样品若干ml于离心管中，按1/1～1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3～5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA(2～3mA/em)，保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2cm时，即可停止电泳。

3、染色：

电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。

四、结果 (略)

五、注意事项

1、SDS与蛋白质的结合按质量成比例(即：1.4gSDS/g蛋白质)，如果比例不当，就不能得到准确的数据。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。

3、有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(α-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。

4、有的蛋白质(如：电荷异常或结构异常的蛋白质;带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。

5、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。