Western blotting细节——献给完全一个人做此实验的xdjm们

新人经验

在正文开始之前，请允许小妹我简单介绍一下个人情况，顺带为即将独自一人做此实验的xdjm们打打气。小妹我上无师兄师姐（上届师姐于我开始做实验时已毕业），下无师弟师妹（下届师弟师妹尚未开学），由于种种原因被老板发配到外院一个生物治疗中心进行我的实验。在我开始做Western时，制胶器及转膜仪等均未开封，老师们均表示以前也未做过Western。

所以我是第一个吃螃蟹的人，吃苦或许是注定的。我自己找了一个常做Western的帅哥（本不认识）学习了大概两天的样子，就独自一人开始了我的Western生涯。从开始到现在总共也不到一个月，所以经验之类我几乎没有，但是之所以斗胆写此文，仅仅不希望下一个与我情况类似的xdjm们犯一些低级错误，我犯的低级错误足以让大神们笑掉大牙（后表）。啰嗦这么久，正式开始吧。

1. 即使没有师兄师姐带，即使在外院，不管条件多么恶劣，找人跟着学习是必须的，不然完全无从下手，最好自己先预习，对实验原理、步骤等等有初步的理解，然后每一步骤争取看上3遍，我只学了两天，太少了，细节问题很多没注意到。

2. 先讲制胶器，玻璃板、梳子都是有规格的，我用的是六一的DYCZ-24DN的，玻璃板分1.0mm和1.5mm的，1.0mm在毛玻璃板（即凹玻璃板）上有注明。梳子分1.0mm和1.5mm的，每种又分10个齿和15个齿的，请新手们注意了，插梳子一是要匹配，即用的1.0mm的凹玻璃板制的胶就只能擦1.0mm的梳子，至于是用10个齿还是15个齿的，可能需要看实验总分组情况吧，一般10个齿的使用较多。

二是梳子有两面，插梳子时使光滑面贴着长玻璃板（对凹玻璃板而言）往下插。我就是没有注意这个细节，第一天就插破了一块凹玻璃板，损失100大洋（一对玻璃板100左右）。浓缩胶凝固后将制胶器底座去掉后放入电泳槽中，倒满电泳液后稍等2分钟左右再拔梳子，这样可避免胶与玻璃板之间出现气泡。

3. 我另一个低级错误是转膜时用错了PVDF膜，因为跟着帅哥学习时看他剪膜时拿出来的袋子里全是蓝色的纸，先入为主的认为蓝色的纸就是膜，并且这样的错误犯了5次之久，当然没有一次是有条带的。直到所在的实验室新招的师姐来看我做实验，说了一句你的膜咋这么透啊。

一句话惊醒梦中人，我当天赶紧拿着我的膜回去问同学，才知真真我一直用错了膜，那一刻若不是因为旁边有人，眼泪就会哗啦啦下来了，5次啊，半个多月之久！所以在此郑重提醒所有新手们：两层蓝色的纸中间夹着的白色的纸才是PVDF膜！

4. 再讲一个有关暗室的问题。因为我所在的实验室在设计、建造阶段可能并没有考虑到暗室这一问题，所以本身是没有暗室的。于是我挖空心思，问了很多同学，查了很多资料（但是几乎没有资料可供参考），暗室到底得达到怎样一个标准才能称之为暗室。有人说必须是本身设计、建造为暗室的房间才能当暗室，又有人说伸手不见五指即可当暗室使用。

我的实战经验是没有窗户，用黑塑料袋封上门上的窗户的房间即可当暗室，简单来说伸手不见五指的房间即可当暗室。其实在曝光了七次之后，暗适应能力大大增强，我做在的暗室已经不是严格的伸手不见五指了，并且墙缝处明显透光，但是这并影响曝光过程的顺利进行。顺带讲一个关于红灯的问题，这个问题对于我们这些非专业人士而言也是众说纷纭，有人说白灯外面裹上一层红布就可当红灯，也有人说这样不行。

最后我发现我的暗室里有两个培养箱，培养箱上显示37.0摄氏度和5.0%的二氧化碳浓度的数字是红色的，实战证明这样的数字可以当红灯用，举一反三，个人认为红灯的要求也并不是非常严格，虽然并不认可白灯外面裹上一层红布就可当红灯，但是我估计灯具商店里白光灯外面罩的是红色塑料壳的灯泡可能可以用（这个才10块以内，真正的红灯不下100大洋），可以用空胶片试验下。

另外有的手机可以发红光，个人认为这个可以使用的可能性也很大。当然实际情况如何，请xdjm们先试验。当然有钱的话就买一个正宗的吧，红灯用来看条带显影得够不够还是很有用的，尤其对新手而言。

5. 再讲一下关于液体使用问题。电泳液我用的是干粉，拿去离子水一溶即可的那种，这个不便宜，建议新手的话先每次都用新的，但是把用过的回收，等熟练了出了漂亮的条带后，考虑用回收液，我用回收液没有考虑什么外槽用回收液，内槽用新的电泳液之类的，实战经验是即使全部用回收液，条带也不受影响。

但是我的电泳液貌似浑浊得很快，用三次就浑了，即使用一次放久了（4度放20了来天）也会浑，浑了当然就不要再用啦，再省也不要冒险啊。另外TBST说什么现配现用，最好当然如此，但是偶尔哪天没用完，第二天或者隔几天肉眼观没有浑浊的话也可以用，有实战经验证明，本园也有帖子证明。不过我用来封闭及稀释抗体的封闭液倒是现配现用的，因为里面有牛奶嘛，直觉都感觉容易坏

6. 本实验中有几处各家有不一样的说法的地方我也发表一下个人看法，当然有的是盗用园子里其他大神的经验。个人认为本实验洗膜就两步：一抗和二抗孵育后，其余的可不洗。个人认为如果对实验结果没有明显的影响，能不做的步骤就不做，这个实验太耗时，能省则省。当然如果要用丽春红染色则另说，对这一步，虽然我也染过两次，但是具体步骤如何，个人认为主要参考你的洗膜液说明书。

7. 个人总结的本实验可调节因素，此处重点说明仅供新手参考，没有经验之谈，仅仅只是总结。上样量的话我制的是1.0mm的胶测内参，上样量25ul，几乎不可能再加了，总蛋白浓度在4-6ug/ul（蛋白定量不够准确，所以只有大概数），按理说这样的上样量高了点，但是条带并没有连线。

另外就是一抗、二抗稀释比，先按说明书的高稀释比来吧，尤其是国产的。至于封闭时间，个人认为一开始就应该至少2小时，再视胶片背景调整。二抗孵育时间个人认为1小时足够。洗膜的话个人认为二抗孵育后的洗膜时间及次数较为重要，第一次至少洗3次，每次10分钟吧，具体再视胶片背景调整。最后就是调节曝光时间和显影时间来调节胶片背景，具体做过一次就知道了哈哈哈。

暂时就这么多了，目前也只是做出了一个比较漂亮的内参，所以经验之类的几乎没有，纯粹只是不想情况与我类似的可怜人在这条路上浪费本不该浪费的时间与精力。此贴为小妹的处女贴，如有不到之处请xdjm们多多海涵。敬请各位赐教！

大神建议

1. 两遍就够了，看一遍，自己做一遍，再去回头再看一遍。

2. 弄破薄玻璃板可以理解，弄破厚玻璃板实在是太配服了，我试过把厚玻璃板从桌上不小心掉到地上也没摔坏；电泳液倒满内槽之后就可以拔了，没必要等两分钟。

3. 原来还有这么多实验室不是用成像仪的啊。

4. 没必要新手每次都用新的电泳液，差别不大，不过转膜液倒是有注意一下，该扔就扔，别可惜；TBST也没必要现配现用，一般一个月都看不出有什么差别的；牛奶只要没有变质都能一直用，但是记得每次用之前闻一闻，一般能用两个月。

5. 1mm的胶，10孔的话最多可以一般最多可以上样到30ul，但是要手很巧，最逆天的时候可以上样到35ul，但是这个除了手巧还跟蛋白的浓度有关，浓度低的话手再巧也上不了这么多。