Northern杂交实验指导之七：结果检测

Northern Blotting技术专题

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方法一、化学发光检测

试剂及其配制：

洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid

150mmol NaCl

0.3%(v/v) Tween20

pH 7.5

Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid

150mmol NaCl

pH 7.5

封闭液：5% (w/v) SDS

17mmol/L Na2HPO4

8mmol/L NaH2PO4

室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。

检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)

100mmol NaCl

TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)

1mmol EDTA

Anti-DIG-AP

CSPD: 25mmol CSPD(用前稀释)

检测程序：

1.杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。

2.将化学发光底物置于室温下。

3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动)，在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。

4.在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。

5.在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。

6.去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.。

7.去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化学发光底物处理之前，膜必须保持湿润，哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。

8.用检测缓冲液稀释CSPD(1∶100)，选择以下方法的一种进行发光底物处理：

a. 单张杂交膜处理：将膜置于一保鲜袋中或两张醋酸纸之间，用镊子轻轻抬起一角，用一消毒的吸管从膜顶端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化学发光底物，让底物溶液均匀扩散到膜的表面，然后将膜放平，用一张湿润的滤纸轻轻排除气泡使膜四周被液体封闭，室温下放置5min.，然后接步骤9。

b. 成批膜处理：取一个干净的盘子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盘中，用一钝头镊子将膜置于其中，轻轻倾斜盘子直到膜表面全部浸有底物溶液，室温下放置5min.，用镊子小心夹住膜的一角，提起使多余液体滴出(切勿使膜干燥)，然后将其置于一干净保鲜袋中。重复以上过程将膜一张一张全部处理完后接步骤9。

9.当膜半干燥时，即刻将膜封闭在保鲜袋中。为了缩短曝光时间，膜需在室温下稳定7～8小时或37℃下15min.，达到稳定态的膜单拷贝基因的检测也只需曝光15min.，如果封膜后马上曝光处理，则曝光时间要60min.。

方法二、NBT-BCIP荧光检测

试剂：Anti-Dig-AP

NBT

BCIP

其它同化学发光检测。

试验程序：

1.杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。

2.将化学发光底物置于室温下。

3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动)，在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。

4.在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。

5.在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鲜袋中处理，要排除气泡;如果在盘子中进行处理，要轻轻摇动，使膜全部浸入抗体溶液中。

6.去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.以除去非结合抗体。

7.与此同时，准备颜色底物溶液，在10ml检测缓冲液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。

8.去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。

9.除去检测缓冲液，加入大约10ml颜色底物溶液，显色反应可以在保鲜袋中进行，也可以在暗盒中进行，显色反应中切勿摇动。在显色反应中，可以短时暴露于光下观察，一般几分钟后开始显色，但完全反应大约需要12小时。

10.显色完成后，用H2O洗膜以终止反应，如果膜还要再用则用TE终止反应。

结果记录可采用影印和照相的方法，膜如果贮存在TE中可长期保存颜色不变。

&NBS p;

试剂及其配制：

洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid

150mmol NaCl

0.3%(v/v) Tween20

pH 7.5

Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid

150mmol NaCl

pH 7.5

封闭液：5% (w/v) SDS

17mmol/L Na2HPO4

8mmol/L NaH2PO4

室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。

检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)

100mmol NaCl

TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)

1mmol EDTA

Anti-DIG-AP

CSPD: 25mmol CSPD(用前稀释)

检测程序：

1.杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。

2.将化学发光底物置于室温下。

3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动)，在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。

4.在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶10000)，3μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。

5.在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。

6.去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.。

7.去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。注意：在使用化学发光底物处理之前，膜必须保持湿润，哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。

8.用检测缓冲液稀释CSPD(1∶100)，选择以下方法的一种进行发光底物处理：

a. 单张杂交膜处理：将膜置于一保鲜袋中或两张醋酸纸之间，用镊子轻轻抬起一角，用一消毒的吸管从膜顶端加入0.5ml(0.5ml/100cm2)化学发光底物，让底物溶液均匀扩散到膜的表面，然后将膜放平，用一张湿润的滤纸轻轻排除气泡使膜四周被液体封闭，室温下放置5min.，然后接步骤9。

b. 成批膜处理：取一个干净的盘子，用消毒吸管取5～10ml底物溶液于盘中，用一钝头镊子将膜置于其中，轻轻倾斜盘子直到膜表面全部浸有底物溶液，室温下放置5min.，用镊子小心夹住膜的一角，提起使多余液体滴出(切勿使膜干燥)，然后将其置于一干净保鲜袋中。重复以上过程将膜一张一张全部处理完后接步骤9。

9.当膜半干燥时，即刻将膜封闭在保鲜袋中。为了缩短曝光时间，膜需在室温下稳定7～8小时或37℃下15min.，达到稳定态的膜单拷贝基因的检测也只需曝光15min.，如果封膜后马上曝光处理，则曝光时间要60min.。

方法二、NBT-BCIP荧光检测

试剂：Anti-Dig-AP

NBT

BCIP

其它同化学发光检测。

试验程序：

1.杂交洗膜后，将膜置于洗膜缓冲液中平衡1min.。

2.将化学发光底物置于室温下。

3.用一个干净的盘子或袋子将膜在封闭液中封闭30～60min.(封闭过程在摇床上轻轻摇动)，在封闭快结束时，按下列方法准备抗体溶液。

4.在第一次使用时，Anti-Dig-AP 在13000rpm.下离心5imin.除去小的凝聚体，以免造成背景过高，以后使用前只需离心1min.。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，6μl Anti-Dig-AP加入30ml封闭液混匀。

5.在封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的抗体溶液，浸膜至少30min.。如果是在保鲜袋中处理，要排除气泡;如果在盘子中进行处理，要轻轻摇动，使膜全部浸入抗体溶液中。

6.去除抗体溶液，用洗膜缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min.以除去非结合抗体。

7.与此同时，准备颜色底物溶液，在10ml检测缓冲液中混合45μl NBT和35μl BCIP，注意避免直接暴露在光下。

8.去除洗膜缓冲液，在检测液中平衡膜2次，每次2min.。

9.除去检测缓冲液，加入大约10ml颜色底物溶液，显色反应可以在保鲜袋中进行，也可以在暗盒中进行，显色反应中切勿摇动。在显色反应中，可以短时暴露于光下观察，一般几分钟后开始显色，但完全反应大约需要12小时。

10.显色完成后，用H2O洗膜以终止反应，如果膜还要再用则用TE终止反应。

结果记录可采用影印和照相的方法，膜如果贮存在TE中可长期保存颜色不变。