DNA的酶切技术

重组DNA技术工具酶

一、实验目的

1.通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA 分子;

2.根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶 ;

3.掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌 中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别：…GAATTC… 切割后产生

…CTTAAG…

…G和AATTC…的末端，

…CTTAAG…

该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团。即…G-OH

…CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别 GATC ;有的识别六

CTAG

碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高(四碱基酶为44=256，六碱基酶为46=4096)，因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I

…GCGGCCGC…

…CGCCGGCG… 则识别和切割位点更少(48=65536)，但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2+为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50%的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl(每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量)。

三、实验材料

待酶切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯

器皿：Eppendorf管、Tip、试管架

试剂：Hind III酶切标准DNA分子量

Hind III限制性内切酶

10×buffer：50mmol/lNaCl

10mmol/lTris-HCl(pH7.5)

10mmol/lMgCl2

lmmol/l DTT(二硫苏糖醇)

五、实验步骤

1.将DNA样品lμg溶解在16μl重蒸水中(在灭菌的Eppendorf管中进行)

2.加入2μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

3.加入1~2u的限制性内切酶Hind III(限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱)。

4.混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育1小时。

5.终止反应加入 0.5mol/l EDTA-Na2至终浓度为10mmol/l。

6.进行电泳检查酶切结果，100V 0.5~1小时。

7.紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1.分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：

(1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

(2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。

(3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2.限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。

若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量(可稍多计一点)，取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。

3.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。

4.样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

5.无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。