PriCells: 藻红蛋白标记抗体的方法﹠PE-标记蛋白A方法

藻红蛋白标记抗体的方法：

1. 巯基化藻红蛋白（PE）的制备；

（1）将600μl浓度为15.5mg/ml的盐酸巯醇亚胺加到1.2ml浓度为3.6mg/ml的PE中；

（2）将以上混合液和1.2ml pH6.8的PB混合，而后装入透析袋置入50mmol/L pH6.8的PB中于4℃透析，过夜；

（3）再换用pH7.5 PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基；

2. 巯基PE-IgG的制备；

（1）将30μl浓度为1.1mg/ml的异双功能试剂SPDP的乙醇溶液，加入到700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50 mmol/L pH7.5），在室温中反应2.5h；

（2）再将400μl浓度为1.7mg/ml的巯基化PE加到500μl反应混合液中，室温反应12h；

（3）加入50 mmol/L的碘乙酸钠100μl来封闭残余巯基，于4℃下用PB透析过夜；

（4）最后加入0.01%的Na3 N3 后分装，于4℃保存半年；

PE- 标记蛋白A方法：

1. 称取4.08mg PE溶于1ml浓度为0.1mmol/ml pH7.4的PBS中，溶解后，取出0.5ml，再加入浓度为2.65mg/ml的SPDP无水甲醇液10μl，SPDP/蛋白质物质的量比为10，22℃反应5min，过Sephadex G-50（1×17cm），用100mmol/L pH7.4的PBS平衡和洗脱；

2. 将0.5ml浓度为2mg/ml的蛋白质和100mmol/L pH7.4的PBS液混合，把2.6μl上述SPDP甲醇液加入混合液中，使得SPDP：蛋白质=9：5，于22℃下放置40min后，再加如25μl pH7.4的二硫苏糖醇（DTT）缓冲液，于22℃下反应25min后，过Sephadex G-50，收集蛋白A峰；

3. 将0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，于22℃下反应6h后，将混合物于4℃保存备用；

4. 将以上两种PE标记制品溶于0.01mol/L pH7.4 PB（含有0.1mol/L DETA、1mol/L 碘乙酰胺、1%BSA和0.1% NaN3 ）中，于0—4℃保存；