从酵母中大规模自然亲和纯化溶解膜蛋白

一、材料与方法 1.  EDTA（无蛋白酶抑制剂）（Roche）   2.  毛地黄皂苷（EMDChemicals）   3.  蛋白酶抑制剂（DMSO，leupeptin，pepstatin）（Sigma）   4.  BECKMAN离心管（BECKMAN）   5.  ANTI-FlagM2亲和树脂（Sigma）   6.  3×FLAG肽（Sigma）   二、设备 1.  AvestinEmulsiflexC3匀浆器（Avestin）   2.  BECKMAN离心机，转子，聚碳酸酯离心管（BECKMAN）   三、步骤 1.  细胞裂解物的制备 （1）收集4 000 OD细胞，OD600在1左右，集菌4升，5 000 rpm，20分钟。每管用100 ml 水洗一次，转移到50 ml 离心管。如果必要在-80℃冻存。   （2）用50 ml 预冷的溶解缓冲液（加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，不加DTT）悬浮细胞，最终为2个50 ml 的样品。   （3）用AvestinEmulsiflexC3匀浆仪破碎细胞。   （4）离心去掉未裂解的细胞，1 000 g 离心2次到3次。   （5）将上清转移到Beckman聚碳酸酯离心管，44 000 g 高速离心，30分钟。   （6）用0.5 ml 溶解缓冲液将微粒体重悬，加14 ml 含2%毛地黄皂苷的免疫沉淀缓冲液（加蛋白酶抑制剂）（溶解缓冲液-山梨醇+15%甘油）。   （7）用nutatinglysate于4度溶解膜蛋白1.5小时，44 000 g 离心30分钟，去除不可溶物质。   2.  FLAG融合蛋白免疫沉淀 （1）每个反应加300 μl 树脂悬液。   （2）充分悬浮ANTI-FLAGM2亲和树脂，转移到15 ml 离心管。   （3）400 g 离心树脂1 min，移除上清。   （4）用5 ml 的4×免疫沉淀缓冲液（加0.1%毛地黄皂苷）洗树脂。   （5）取15 ml 细胞裂解物，加ANTI-FLAG树脂，免疫沉淀3小时或者4℃过夜。   （6）用10 ml 的4×免疫沉淀缓冲液（加0.1%毛地黄皂苷）洗树脂，将树脂转移到1.5 ml 离心管。   3.  FLAG融合蛋白的洗脱 用3×FLAG肽洗脱。 （1）制备3×FLAG洗脱缓冲液：加150 μl 1×免疫沉淀缓冲液，0.25%毛地黄皂苷，1 μg/μl 3×FLAG。   （2）向树脂中加150 μl 3×FLAG洗脱液。   （3）4度轻晃30分钟。   （4）400~1 000× g 离心1分钟，将上清移到新的离心管。   （5）再向树脂中加150 μl 3×FLAG洗脱液，重复洗涤1次，合并洗脱后溶液。