核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交

本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。

(一)样品DNA内切酶水解

限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。

1、配液：10×限制性酶消化缓冲液

10×buffer O—无盐：100mmol/l Tris HCL pH7.4

1mg/ml BSA

100mmol/l MgCL2

10mmol/l DTT(二硫苏糖醇)

10×bnffer l—低盐：缓冲液O

0.5mol/l Nacl

10×bnffer H—高盐：缓冲液O

1.0mol/l Nacl

2、操作步骤：

(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μl，混匀。

(2)加入2ml 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。

(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。

(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。

(5)加入0.5mol/l EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/l终止反应。

(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。

(二)Southern Blot及杂交。

将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。

1、配液：

(1)变性溶液：1.5mol/l Nacl 0.5mol/l NaoH

(2)中和溶液：200ml 20×SSC

100ml 1mol/l HCL

100ml 1mol/l Tris HCl pH8.0加水至500ml。

(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。

(4)预杂交液：12.5ml 1mol K3 PO4 pH7.4

125ml 20×SSC

25ml 100×Denhardt’S溶液

5ml 5mg/ml鱼精DNA

250ml 100%去离子甲酰胺

82.5ml H2O(总体积为500ml)

(5)100×Denhardt’S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)

10g聚乙烯吡咯烷硐

10g牛血清白蛋白(组分V)

加H2O至500ml

2、操作步骤(如图20-1)：

(1)内切酶消化的DNA，总体积为50μl，加入10μl加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。

(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。

(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：

500ml 0.2mol/l HCL 10分钟，水洗若干次

500ml变性液中浸泡15分钟×2

500ml中和溶液浸泡30分钟。

(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。

(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。

(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时

(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。

(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。

(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。

(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。

(11)取出转移膜，按以下条件洗膜

1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟

0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。

(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。

(13)X片显影、定影，然后读片

结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。