亲和层析技术研究进展

亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。

亲和层析技术的最大优点在于.利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品，亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。

近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一。

本文讲述了亲和层析的技术要点，介绍了免疫亲和层析、金属离子亲和层析等主要的亲和层析方法，还介绍了各种亲和层析联用技术。

1 亲和层析的一般问题

1.1 配基的选择

将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质，选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白，选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基。

1.2 载体的选择

将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因此，亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求:(1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大;(2)物理

和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长;(3)含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化;(4)粒径均一的球形粒子。常用的亲和层析载体有:琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有:聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。

1.3 基质活化和偶联

大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活化基质通常经过与抗体表面残基的—NH反应将抗体偶联，偶联反应也可通过与抗体表面的一0H、一C00H或一NH进行。

在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间，以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响。当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会阻碍抗体与抗原的相互作用。

最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳定的基质已商品化，在仅仅需要少量基质时可以购买。如果基质的需要量大，自己进行活化更为经济。

1.4 洗脱问题

洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法，通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强，当连续通过大体积的平衡缓冲液时，便可在紧随杂蛋白洗出蜂后，得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子，必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法，利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离，再分出欲纯化的生物大分子。

2 免疫亲和层析

抗原和抗体的作用具有高度的专一性，并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。

2.1 抗体的纯化

抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要，所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得。

2.2 抗原的纯化

在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000~10000倍。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明，并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤，那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法。

抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度，制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性，又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的，其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率，经常制备的是小而粗的柱子，同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样，以便纯化更多的抗原蛋白。此外，较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。

2.3 应用举例

免疫亲和色谱在实验室被广泛用于蛋白质的分离纯化，目前IAC在治疗产品大规模生产上的应用受到价格、配体的渗漏和IAC吸附剂抗原结合容量低等问题的限制。

单抗问世后、不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基，这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善将降低IAC吸附剂的价格。

随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对IAC研究的深人，必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用逐渐得到发展。