western blotting的一些个人经验

个人经验,仅供参考:

1.用脱脂奶粉封闭的效果不一定比用BSA 差,不过我们试过几种奶粉,有一些奶粉不太适合.推荐使用的奶粉:雀巢高钙奶粉,多力精低脂奶粉.一般国产的奶粉的颗粒比较大,不太容易溶解.

2.关于三名治:本人以前做时花很多时间在防止短路上,现在我做的时候根本没有剪齐,最主要的是赶气泡,这是关键的关键,其实转膜的原理是电流的单向流动,现在的好多公司的转膜装置的电极是一个平面,所以不用担心短路的.(不信的可以试试!!)

3.关于转膜时的温度:转膜时的温度比较重要,最好保持在10度以下,可以用冰浴(Pharmacia的转膜装置),也可以在转膜液中放入合适的事先准备的冰袋(-70度>3小时)(Bio-Rad),这样既可以降温又可以节约Buffer.

4.关于转膜电流和时间:一般转膜的电流在200mA-400mA之间时间为1小时,大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA,不过本人觉得上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去.

5.关于反复标记和再标记:一张膜上可以同时标记很多抗体,但要注意,一般在两个目的蛋白相差在5KD以上的,最好先后两个抗体是不同的二抗.在两个目的片段相差小于5KD时,就需要经过处理,再标记了(Re-Blot),有些公司有再标记的现成试剂,不过比较贵,最简单的方法是:ddH2O洗5分钟,0.2MNaOH5分钟,再用ddH2O5分钟*3次,然后可以再标记了.要做多个抗体的膜的选择,最好用PVDF或教坚固的,推荐用Amsham的Hybond-P,Hybond-Extra.本人最多在一张膜上做个10个不同的抗体.