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微生物学

逆转录病毒感染悬浮细胞(上清感染)

2024-04-17 微生物学 加入收藏
原理逆转录病毒(Retrovirus) 来源于可感染人和小鼠细胞的 Moloney 鼠白血病病毒(Mo-MLV),和慢病毒一样是一种 RNA 病毒。这类病毒可通

原理

逆转录病毒(Retrovirus) 来源于可感染人和小鼠细胞的 Moloney 鼠白血病病毒(Mo-MLV),和慢病毒一样是一种 RNA 病毒。这类病毒可通过逆转录成为原病毒,然后整合在宿主的基因组中,随着细胞分裂可以稳定的遗传下去。因此。逆转录病毒适合介导外源基因在宿主细胞中长期稳定表达。

用途

用于构建稳定细胞系;高效感染免疫系统来源的可分裂型细胞。

材料与仪器

无菌 1 × PBS,293T 细胞,鼠源 CD8+T 细胞,opti-mem 培养基,转染试剂(Lipofectamine3000 等),逆转录病毒质粒,聚凝胺(Poly brene), 细胞培养箱,细胞计数器等。

步骤

(1)293T 细胞转染(产病毒,病毒包装)

Day1:取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中,该细胞于第二天能长至 90% 即可进行转染。

Day2:根据转染试剂说明书,分别用 opti-mem 培养基孵育质粒和转染试剂若干分钟后,轻柔混匀,逐滴加入至 293T 细胞中。

Day4:收集培养第 48 h 的 293T 细胞病毒上清液,用于感染 T 细胞(详情见步骤 2),并更换新鲜培养基培养 293T。

Day5:收集培养第 72 h 的 293T 细胞病毒上清液,用于感染(详见步骤 2)

(2)感染 CD8+T 细胞(第一次感染)

以 CD8+T 细胞为例:

Day3:通过细胞计数,按 1 × 106/孔的细胞数铺入 48 孔板,每孔加入 1 ml 的 T 细胞培养基(加入 IL-2 细胞因子及 OVA 蛋白肽,用于刺激细胞),激活 CD8+T 细胞。

Day4:收集 48 h 的病毒上清液并离心(600 g,4 ℃,15 min),离心后,将上清液经 0.45 μm 滤器过滤转移至新的离心管中,备用。观察 CD8+T 细胞刺激情况,并弃去约 800 μl 培养基。每孔加入 1 ml 离心后的病毒上清液(加入 0.6 μl Poly brene/ml),并轻柔混匀每孔细胞。封板,2 200 rpm,37 ℃ 离心 2 小时,放入培养箱静置 4 小时。4 小时后,弃病毒上清 800 μL,加入 T 细胞培养基 1 ml;封板,2 200 rpm,37 ℃ 离心 5 分钟;弃上层培养基 800 μL,加入 T 细胞培养基至 1 ml,放入培养箱培养。  

(3)二次感染 CD8+T 细胞

收集 72 h 的病毒上清液并离心(600 g,4 ℃,5 min),对于 CD8+T 细胞,弃去 800 μl 培养基,加入 1 ml 离心后的病毒上清液,封板,2 200 rpm,37 ℃ 离心 2 小时,放入培养箱静置 4 小时。具体流程同第一次感染一样,见步骤(2)。

(4)检测 CD8+T 细胞感染效率

取感染后 3 天的 CD8+T 细胞若干,根据质粒的标签,进行流式染色或者 Western blot 效率验证。

注意事项

1、293T 细胞不能铺得太稀或者太满,确保 24 h 内进行转染,否则产病毒颗粒效率低,导致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 观察培养基颜色是否为橙红色,若出现黄色或者金黄,说明 293T 状态不行,或者铺板时候细胞太多了。出现该情况不建议再进行感染,放弃本次实验。

3、收集 72 h 病毒后,可取部分 293T 细胞进行转染效率验证。

常见问题

1、293T 细胞铺得过稀或过多,根据实验室摸索,按 10-12 × 106 的细胞数铺入 10 cm 大皿,第二天能达到 90%。

2、感染效率低或者没感染进去(排除以上注意事项外,可以考虑浓缩感染)

3、避免转染以及感染过程的无菌操作避免污染。


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