逆转录病毒感染悬浮细胞（上清感染）

逆转录病毒（Retrovirus） 来源于可感染人和小鼠细胞的 Moloney 鼠白血病病毒（Mo-MLV），和慢病毒一样是一种 RNA 病毒。这类病毒可通过逆转录成为原病毒，然后整合在宿主的基因组中，随着细胞分裂可以稳定的遗传下去。因此。逆转录病毒适合介导外源基因在宿主细胞中长期稳定表达。

用于构建稳定细胞系；高效感染免疫系统来源的可分裂型细胞。

无菌 1 × PBS，293T 细胞，鼠源 CD8+T 细胞，opti-mem 培养基，转染试剂（Lipofectamine3000 等），逆转录病毒质粒，聚凝胺（Poly brene）， 细胞培养箱，细胞计数器等。

（1）293T 细胞转染（产病毒，病毒包装）

Day1：取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中，该细胞于第二天能长至 90% 即可进行转染。

Day2：根据转染试剂说明书，分别用 opti-mem 培养基孵育质粒和转染试剂若干分钟后，轻柔混匀，逐滴加入至 293T 细胞中。

Day4：收集培养第 48 h 的 293T 细胞病毒上清液，用于感染 T 细胞（详情见步骤 2），并更换新鲜培养基培养 293T。

Day5：收集培养第 72 h 的 293T 细胞病毒上清液，用于感染（详见步骤 2）

（2）感染 CD8+T 细胞（第一次感染）

以 CD8+T 细胞为例：

Day3：通过细胞计数，按 1 × 106/孔的细胞数铺入 48 孔板，每孔加入 1 ml 的 T 细胞培养基（加入 IL-2 细胞因子及 OVA 蛋白肽，用于刺激细胞），激活 CD8+T 细胞。

Day4：收集 48 h 的病毒上清液并离心（600 g，4 ℃，15 min），离心后，将上清液经 0.45 μm 滤器过滤转移至新的离心管中，备用。观察 CD8+T 细胞刺激情况，并弃去约 800 μl 培养基。每孔加入 1 ml 离心后的病毒上清液（加入 0.6 μl Poly brene/ml），并轻柔混匀每孔细胞。封板，2 200 rpm，37 ℃ 离心 2 小时，放入培养箱静置 4 小时。4 小时后，弃病毒上清 800 μL，加入 T 细胞培养基 1 ml；封板，2 200 rpm，37 ℃ 离心 5 分钟；弃上层培养基 800 μL，加入 T 细胞培养基至 1 ml，放入培养箱培养。  

（3）二次感染 CD8+T 细胞

收集 72 h 的病毒上清液并离心（600 g，4 ℃，5 min），对于 CD8+T 细胞，弃去 800 μl 培养基，加入 1 ml 离心后的病毒上清液，封板，2 200 rpm，37 ℃ 离心 2 小时，放入培养箱静置 4 小时。具体流程同第一次感染一样，见步骤（2）。

（4）检测 CD8+T 细胞感染效率

取感染后 3 天的 CD8+T 细胞若干，根据质粒的标签，进行流式染色或者 Western blot 效率验证。

1、293T 细胞不能铺得太稀或者太满，确保 24 h 内进行转染，否则产病毒颗粒效率低，导致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 观察培养基颜色是否为橙红色，若出现黄色或者金黄，说明 293T 状态不行，或者铺板时候细胞太多了。出现该情况不建议再进行感染，放弃本次实验。

3、收集 72 h 病毒后，可取部分 293T 细胞进行转染效率验证。

1、293T 细胞铺得过稀或过多，根据实验室摸索，按 10-12 × 106 的细胞数铺入 10 cm 大皿，第二天能达到 90%。

2、感染效率低或者没感染进去（排除以上注意事项外，可以考虑浓缩感染）

3、避免转染以及感染过程的无菌操作避免污染。