慢病毒感染悬浮细胞（浓缩感染）

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，慢病毒具有更广的宿主范围，对于分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

重组蛋白，抗体生产，基因编辑，功能性研究和移植瘤构建。

无菌 1 × PBS，293T 细胞，鼠源 CD8+T 细胞，opti-mem 培养基，转染试剂（Lipofectamine3000 等）, 慢病毒质粒（psPAX2/pMD2.G/载体质粒），细胞培养箱，细胞计数器等。

（1）293T 细胞转染（病毒包装）

Day1：取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中，使该细胞于第二天融合度达到 90% 左右。

Day2：在 24 小时之内，观察 293T 细胞的汇合度在 90% 时，根据转染试剂说明书向其中加入 DNA-脂质体复合体，制备方法如下：

a）在 500 µl Opti-MEM 无血清培养基中加入转染试剂，混合均匀并置于室温 5 分钟。

b）在 500 µl Opti-MEM 无血清培养基中稀释 DNA，总质量为 15 µg 按照载体质粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。

c）将稀释后的 a）和 b）轻轻混匀，常温静置 20 分钟，形成 DNA-脂质体复合体。

Day3：将复合体轻柔的滴加至细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿混匀，放入细胞培养箱中培养。

Day4：收集培养第 48 h 的 293T 细胞病毒上清液，将收集到的病毒上清放置于 4 ℃ 冰箱中。并更换新鲜培养基培养 293T。

Day5：收集培养第 72 h 的 293T 细胞病毒上清液，合并 48 h 的病毒上清液。

（2）浓缩病毒

将合并的病毒上清液取出，待用。将离心机温度降温到 4 ℃，600 g，离心 15 分钟，取上清液经过 0.45 µm 滤头过滤转移至新的离心管中。配置病毒浓缩液，病毒浓缩液的配置方法如下：

将浓缩后的病毒放置于 4 ℃ 冰箱摇床，旋转过夜。

（3）感染 CD8+T 细胞

a）离心浓缩后的病毒：浓缩后的病毒过夜放置，在离心机 4℃ 条件下，10 000 g，离心 2 小时。

b）激活 CD8+T 细胞：通过细胞计数，按 0.3 × 106/孔的细胞数铺入 96 孔板，每孔加入 300 µl 的 T 细胞培养基 (加入 CD3e/CD28，用于刺激细胞)，激活至第三天感染。

c）在 CD8+T 细胞刺激的第三天将病毒加入细胞中：将离心后的病毒的上清完全去除，用 T 细胞培养基重悬病毒（一个 10 cm 大皿可以感染两个孔，每孔 200 µl），在其中加入 PolyBrene，终浓度为 7.5 µg/ml。去除 CD8+T 细胞中的大部分培养基，向其中加入重悬好的病毒，并轻柔混匀每孔细胞。

d）封板，2 000 rpm，37 ℃ 离心 90 分钟，放入培养箱静置 4 小时。将离心后的细胞放入细胞培养箱中进行培养，2~4 小时后吸弃病毒上清，补加新鲜的 T 细胞培养基。

（4）检测 CD8+T 细胞感染效率

将感染后第二天的 T 细胞从 96 孔板转移到 48 孔板中，根据细胞的密度分孔培养，补加新鲜培养基。取感染后 3 天的 CD8+T 细胞若干，根据质粒的标签，进行流式染色或者 Western blot 效率验证。

1、293T 细胞不能铺得太稀或者太满，确保 24 h 内进行转染，否则产病毒颗粒效率低，导致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 观察培养基颜色是否为橙红色，若出现黄色或者金黄，说明 293T 状态不行，或者铺板时候细胞太多了。出现该情况不建议再进行感染，放弃本次实验。

3、收集 72 h 病毒后，可取部分 293T 细胞进行转染效率验证。

1、293T 细胞铺得过稀或过多，根据实验室摸索，按 10-12 × 106 的细胞数铺入 10 cm 大皿，第二天能达到 90%。

2、感染完后细胞状态不好应及时换液

3、感染效率极低，可能考虑细胞不易转染，或者是细胞状态不好。