最小抑菌浓度（MIC）测定——微量稀释法

最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration， MIC）是指能够抑制微生物生长、繁殖的最低药物浓度。MIC 测试方法有很多种，常见的测试方法有如下三种：微量稀释法、琼脂稀释法、E-test 法。本次详细介绍微量稀释法。

将抗菌药物与待测微生物在一定的稀释范围内进行培养，通常是在每毫升（mL）100 万个菌落形成单位（CFU）的悬浮浓度时，测定抗菌药物不同浓度下微生物的生长情况。由于微生物的存在，没有抗菌活性的测试体系会出现浑浊，而没有浑浊则表明待测微生物的生长受到了抑制。

测定药物的最小抑菌浓度，评价药物的抗菌活性及抑菌能力。

灭菌阳离子调节培养基 Mueller-Hinton Broth（CAMHB）

待测药物粉剂、待测菌株、灭菌生理盐水

灭菌双蒸水、固体培养基

无菌 V 型 / U 型底 96 孔培养板

麦氏浊度仪、灭菌塑料比浊试管

多道移液器

1. 提前将待测菌株接种于相应固体培养平板上，于 37 ℃ 细菌培养箱中过夜培养。

2. 分别称取适量待测抗菌药物粉剂，加灭菌双蒸水充分溶解，配制成贮存液备用。

3. 按实验需求，使用 CAMHB 液体培养基稀释贮存液至最高待测药物浓度，取无菌 96 孔板，在生物安全柜中进行药物稀释，具体操作为：

第一孔（A1）加入 200 μL 最高待测浓度药物，A2~A12 孔加入 100 μL CAMHB 液体培养基，随后从 A1 孔吸出 100 μL 加入 A2 孔，混匀后再从 A2 孔吸出 100 μL 加入 A3 孔，以此类推梯度稀释到 A12 孔，并舍弃最后 100 µL 稀释后的液体。

4. 在透明塑料试管中加入 1 mL 灭菌生理盐水；置于浊度仪上调零，随后挑取待测菌株充分溶于生理盐水，震荡混匀，调整浊度于 0.4～0.6 麦氏浊度（MCF）之间，继续用灭菌生理盐水稀释 20 倍备用。

5. 将 10 μL 稀释后的菌悬液依次加入每个浓度的药物孔（A1~A12）中；将 96 孔板置于 37 ℃ 细菌培养箱中培养 16~18 h。

6. 读取没有细菌生长的最低药物浓度，即为该细菌对该药物的最小抑菌浓度（MIC）。

7. 药敏试验以大肠埃希菌 ATCC25922 等标准菌株作为质控菌株，药敏判断标准参照 CLSI、EUCAST 指南。

1. 每次实验时应根据待测菌的不同而分别选用：金黄色葡萄球菌 ATCC25923、大肠埃希菌 ATCC25922、粪肠球菌 ATCC29212 和铜绿假单胞菌 ATCC27853 等标准菌株在同一试验条件下作平行试验，常用抗菌药物对这些标准菌株的 MIC 应在预期值范围内。

表 1 质控菌株 MIC 范围 （mg/L）

2. 培养基要求是适合微生物生长，有些微生物对培养基中的成分有特殊的要求，要用特殊的培养基才能进行药敏试验：例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用 HTM 琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加 5% 羊血的巧克力 MH 琼脂；肺炎链球菌的药敏试验用 MH 加 5% 的脱纤维羊血培养基。

3. 不同抗生素的稳定性不同，抗生素贮存液最好现配现用，或低温保存，若出现明显的状态变化，应重新配置。

4. 某些特殊药物需要根据药物性质预处理培养基以消除拮抗成分；如头孢地尔的药敏试验使用去除铁离子的 CAMHB。

质控组的 MIC 不在预期范围内称为失控，常见的影响 MIC 测定结果的因素如下：

（1）培养基：培养基的 pH、渗透压及电解质对 MIC 有影响；　　

（2）抗菌药物：抗菌药物必须采用标准粉剂。配好的药物原液应在有效期内使用；　　

（3）结果观察时间：大部分微生物在 12～18 h 观察，有的病原微生物在 20～24 h 观察。培养时间过长，被轻度抑制的部分病原菌可重新开始生长；另外由于某些抗菌药物不够稳定，培养时间过长使其抗菌活性降低，甚至消失，从而使 MIC 值增高。