简易单孢子分离法

简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。

1. 厚壁磨口毛细滴管的制备

截取一段玻璃管，在火焰上烧红所要拉细的区域，然后用镊子夹住其尖端，在火焰上拉成很细的毛细管。从尖端适当的部位割断，用砂轮或砂纸仔细湿磨。使管口平整，光滑。

2. 分离小室的准备

取无菌培养皿（D9 cm）倒入约 10 ml 4% 水琼脂作保湿剂。在皿盖上用记号笔（最好用红色）如图所示画方格。待凝后倒置于 37℃ 恒温箱烘数小时。使皿盖干燥。

3. 萌发孢子悬液的制备

3.1 孢子悬液的制备

用接种环挑取米曲霉孢子数环接入盛有 10 ml 查氏培养液及玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡 5~10 min。使孢子充分散开。

3.2 过滤

用无菌漏斗（塞棉花）或自制的过滤装置将上述充分散开的孢子液过滤，收集过滤液。

3.3 孢子萌发

将孢子过滤液用血球计数板测定孢子的浓度，再用查氏培养液调整孢子液至 0.5~1.5 × 106 个孢子 1 毫升后置 28℃ 培养 8 h。

3.4 点样

用无菌自制的厚壁磨口毛细滴管吸取萌发孢子液少许，快速轻巧地点在培养皿的内壁的方格内中，每微滴面积略小于显微镜低倍镜视野。依次将每方格点上萌发孢子液，成为分离小室最后将皿盖小心快速翻过来，盖在原来的平板上。

3.5 镜检

按图 VII-7 所示，将点样的分离小室平板放在显微镜镜台上，用低倍镜逐个检查皿盖内壁上的微滴．如果观察到某微滴内只有一个萌发孢子时用记号笔在皿盖上作上记号。

3.6 加薄片培养基

取少量查氏琼脂培养基倒入无菌培养皿（培养限先置 45℃ 预热）中制成薄层平板。待其凝固后用无菌小刀片将平板琼脂切成若干小片（其面积应小于培养皿盖上所画小方格的面积），然后挑一小片放在作有记号的单孢子微滴上，其他依次进行，最后盖好皿盖。

3.7 培养

将分离小室平板置 28℃ 培养 24 h，直至单孢子形成微菌落。

3.8 转种

用无菌微型小刀小心地挑取长有微菌落的琼脂薄片移至新鲜的查氏培养基斜面或液体培养中，置 28℃ 培养 4～7d。即可获得由单孢子发育面成的纯培养。

毛细滴管要求达到点样时出液均匀、快速，每微升孢子悬液约点 50 微滴。每滴的大小略小于低倍镜的视野。