动物病毒的鸡胚培养实验

本实验用痘苗病毒和鸡新城疫病毒接种鸡胚。痘苗病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。

痘苗病毒（Vavvinia virus） 鸡新城疫病毒（Newcaatle distase virus） 白壳受精卵
2.5％ 碘酒 70％ 乙醇
孵卵器 检卵灯 齿钻 磨壳器 钢针 蛋座木架 注射器 镊子 剪刀 封蜡 灭菌培养皿 灭菌盖玻片

1. 准备蛋胚

孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是 45～60％），孵育 3 d 后，鸡卵每日翻动 1～2 次。孵至第 4 d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

2. 接种

2.1 绒毛尿囊膜接种

2.1.1 将孵育 10～12 d 的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。

2.1.2 用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约 5～6 mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。

2.1.3 用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。

2.1.4 用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图 1）。

图 1　绒毛尿囊膜接种法
A. 接种前的准备；B. 接种后鸡卵的状态

2.1.5 用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0.05～0.1 ml 痘苗病毒液于绒毛尿囊膜上。

2.1.6 在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行 37℃ 培养，48～96 h 观察结果。

温度对痘苗病毒等病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在 37℃，高于 40℃ 的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。

2.2 尿囊腔接种

用孵育 10～12 d 的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。

2.2.1 将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。

2.2.2 将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。

2.2.3 用带 18 mm 长针头的 1 ml 注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入 0.1 ml 病毒液（图 2）。

图 2　尿囊腔接种

2.2.4 用石蜡封孔后于 37℃ 孵卵器孵育 72 小时。

2.3 羊膜腔接种

2.3.1 将孵育 10～11 d 的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

2.3.2 用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约 1 cm 的裂痕。

2.3.3 用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。

2.3.4 用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图 3）。

图 3　羊膜腔接种

２3.5 左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有 26 号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液 0.1 ml。针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。

2.3.6 用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于 37℃ 孵卵器内孵育 48～72 小时，保持蛋胚的钝端朝上。

鸡胚接种病毒的操作过程及使用器械应严格无菌，尽可能在无菌工作台上进行。

3. 收获

3.1 绒毛尿囊膜

3.1.1 用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。

3.1.2 将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。然后或用于传代，或用 50％ 甘油保存。

3.2 尿囊腔接种法收获尿囊液

3.2.1 将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。

3.2.2 用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。

3.2.3 将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获 6 ml 左右尿囊液，收获的尿囊液暂贮 4℃ 冰箱，经无菌试验合格后于 -30℃ 长期贮存。

3.2.4 观察鸡胚，看有无典型的症状。

3.3 羊膜腔接种法收获羊水

3.3.1 按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。

3.3.2 先吸出尿囊液。

3.3.3 再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸 0.5～1.0 ml。经无菌试验后，保存于低温中。

3.3.4 观察鸡胚的症状。