培养细胞中病毒 DNA 的提取
一、简介
在用PCR技术检测病毒DNA和RNA过程中，病毒核酸的提取，也即DNA模板的制备，至关重要。
二、操作方法
培养细胞中病毒 DNA 的提取
三、原理
<link />
四、材料与仪器
细胞
裂解液 TE 缓冲液
培养瓶 EP管 真空泵
五、步骤
1. 贴壁培养细胞倾去培养液，加 PBS 洗 2次,加胰蛋白酶消化 (37℃, 5~10 min)后移入Ep管中，2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液，用 PBS 悬浮细胞，离心洗涤 2~3次，用 PBS 重新悬浮细胞， 3500 r/min, 弃上清液。
2. 悬浮细胞的培养 移入 Ep 管中，以 2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液，用 PBS 悬浮细胞，余下的操作同贴壁培养细胞。
3. 加人 1/2 体积 2M NaCl 和 1/2 体积 20% PEG 6000( 聚乙二醇 6000), 充分混匀溶解，置于 4℃ 8~12 h 或过夜， 3500 r/min 离心 20 min, 弃上清液。
4. 加 1/10 原培养液体积的裂解液，混匀， 37℃作用 2~3 h 。
5. 用等体积的平衡酚抽提 1次，再用氯仿／异戊醇 (24:1)抽提 3~4次。
6. 加入 1/10 体积 2.5mmol/L NaAc pH 和 2倍体积无水乙醇，置- 20℃过夜。 15000 r/min 离心 10 min, 弃上清液，用 70% 乙醇洗 1次，倒置离心管自然干燥或真空抽干。
7. 加适量 TE 缓冲液溶解沉淀，做 DNA 模板。获得病毒DNA。
六、注意事项
<link />
七、常见问题
1. 裂解液由 0.5%SDS 、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5 mmol/L EDTA 、10 µg/ml RNase和 50µg/ml 蛋白酶 K 组成。
2. TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8) 和 10 mmol/L EDTA 组成。
相关文章
