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微生物学

全血细胞中病毒 DNA 的提取

2024-04-20 微生物学 加入收藏
一、简介在用PCR技术检测病毒DNA和RNA过程中,病毒核酸的提取,也即DNA模板的制备,至关重要。二、操作方法全血细胞中病毒 DNA 的提取三、原理<l

一、简介

在用PCR技术检测病毒DNA和RNA过程中,病毒核酸的提取,也即DNA模板的制备,至关重要。

二、操作方法

全血细胞中病毒 DNA 的提取

三、原理


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四、材料与仪器

全血
裂解缓冲液 A 裂解缓冲液 B 蛋白酶 K
离心机 水浴锅


五、步骤

1. 在 750µl 全血中加入等量裂解缓冲液 A,混匀, 12000 r/min 离心 30 s, 弃上清液。


2. 用 1.5mL 裂解缓冲液 A 悬起沉淀,再重复离心 1次,弃上清液。


3. 用 117µL 裂解缓冲液 B 溶解沉淀, 70℃作用 5 min, 待冷却至 55℃时加入3µL 蛋白酶 K, 并保温1h 消化细胞, 95℃ 10 min 灭活蛋白酶 K 。


4. 加入 2 mol/L 的 KCL 溶液 30µL, 冰溶 5 min 。


5. 12000 r/min 离心 5 min, 弃上清液做 DNA 模板。即获得病毒DNA。

六、注意事项

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七、常见问题

1. 裂解缓冲液 A 由 320 mmol/L蔗糖、 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6) 、 5mmol/L MgCl2和1% Triton-X-100 组成。


2. 裂解缓冲液 B由10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6) 、 1% SDS 组成。


3. 蛋白酶 K(25 mg/ml) ,ddH2O配制,-20℃保存。




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