斑点免疫酶染色法 (dot-ELISA)实验 （以检测轮状病毒抗原为例说明）
一、简介
免疫酶染色试验一般都由两部分组成，即一次或数次抗原和抗体的免疫学反应和一次酶促反应。第一步抗原抗体结合中，酶结合物起抗体作用，在第二步加入底物后，酶起到了催化的生物放大作用。该方法具有敏感性高，标本可长期保存，使用一般光学显微镜就能观察等优点，但有时也存在非特异性染色的问题。
二、操作方法
斑点免疫酶染色法 (dot-ELISA)实验 （以检测轮状病毒抗原为例说明）
三、原理
该技术是进行 ELISA 测定时，借用了免疫印迹技术的某些原理和方法，利用硝酸纤维素膜为固相载体，使抗原抗体反应在膜上进行，结合在硝酸纤维素膜上的酶抗体结合物通过将底物分解成不溶性的产物而沉积，在硝酸纤维素膜上形成斑点。待测抗原或抗体含量的高低可通过膜上斑点颜色的深浅来判断。
四、材料与仪器
轮状病毒；
抗轮状病毒免疫血清，酶标记抗轮状病毒单克隆抗体或多抗，二氨基联苯胺，封闭液，稀释液，PBS，洗涤液，0.05 % Tween 20，Tris-HCl；
微孔滤膜：硝酸纤维素滤膜；微孔板：可用酶标板或血凝板；
五、步骤
1) 根据微孔板孔的大小，将滤膜切成大小合适的小条，编号。
2) 抗体点膜：用微量注射加样器取包被抗体加在滤膜一端，每点 2µl, 室温干燥固定 30 min 。
3) 封闭：用含10 g/L 牛血清白蛋白的 0.Olmol/L PBS (pH 7.4)37℃封闭1h,凉干后置 4℃冰箱备用。
4) 加粪样：取待测病人粪样上清 100 µl 加入微孔板孔内，然后插入已包被抗体的滤膜小条，置湿盒 37℃ 45 min。同时设阳性及阴性对照。
5) 洗涤：取出滤膜小条，置平皿中用洗涤液洗 3 次，每次3min 。
6) 加酶标抗体：取 100 µ1 稀释的酶标抗体加人另一微孔板孔内，插入洗涤后的滤膜小条，置湿盒 37℃ 45 min 。
7) 洗涤：取出滤膜小条，置平皿中用洗涤液洗 3 次，每次3min 。
8) 底物显色：将洗涤后的滤膜小条浸入新配制的底物溶液中，显色5min。用蒸熘水洗去底物溶液，终止显色。
(3) 结果：肉眼观察，棕色斑点为阳性，未着色斑点为阴性。
六、注意事项
良好的病毒抗原片是正确判断染色结果的基础，染色过程中每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果。应注意以下几点：
1. 标本的固定方式和温度要正确，同时设立阳性和阴性对照。
2. 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶的抗体，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液，一抗的使用浓度过高会使整个切片全都染上了颜色；检查底物溶液是否有效。
3. 所有的试剂要按正确的顺序加入，不要忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
4. 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的 pH 值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
5. 温育的时间要足够，温育时切片要放平，否则会导致抗体流失。
6. 清洗要充分。
七、常见问题
操作更为方便、简单和经济实用。其与经典 ELISA 检测的主要区别是：多数采用硝酸纤维膜作为载体，而不是聚苯乙烯微孔反应板；所用酶底物经分解后在局部产生不溶性产物沉淀。
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