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微生物学

二倍体细胞的孢子形成

2024-04-23 微生物学 加入收藏
一、简介一种新的酵母菌株的构建方案分为几个不同的步骤:①二倍体的构建,在这里两个单倍体进行交配;②孢子形成,在这里二倍体细胞被诱导形成孢子;③四分体孢子的制备,

一、简介

一种新的酵母菌株的构建方案分为几个不同的步骤:①二倍体的构建,在这里两个单倍体进行交配;②孢子形成,在这里二倍体细胞被诱导形成孢子;③四分体孢子的制备,在这里囊壁被从四分体孢子上除去;④四分体孢子的分离,在这里来自一个单独的四分体 抱子的四个单倍体抱子中的每一个都被明确地安置在一块平板上,并继续生长用作以后的研究。






  二、操作方法

   二倍体细胞的孢子形成

三、原理

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  四、材料与仪器

酵母菌细胞
孢子形成平板或孢子形成培养基 适当的营养成分 YPD培养基
平板

  五、步骤

1)挑YPD或选择性平板上的酵母菌单菌落接种在孢子形成平板上。如果无需选择的话,细胞在转移到孢子形成平板之前,可以在YPD平板上先培养几天。单个菌落在YPD平板上生长3〜4天,而对成小块细胞来说,可在YPD平板上生长2天。这种预生长并 非必需的,但它可以使孢子形成的效率更高些。在转移酵母细胞时,应用少量细胞在孢子形成平 板上涂布相对较大的面积(约1cm2),不应见到成团的接种物。


2)于25℃培养4天。在较髙的温度下孢子形成的效率一般很低。在缺乏氨基酸或其他酵母菌有丝分裂生长所必需的营养成分时,酵母菌就会进行减数分裂形成孢子。某些特殊的酵母菌必须添加特定的营养成分孢子 形成才会更加完全。


3)在载玻片上滴一滴水,挑少量细胞稀释在水中,于放大倍数250×〜400×显微镜下观察悬浮于水中的四分体孢子。


4)四分体呈成簇的4个小球(孢子),被固定于一个致密的子囊中。四个孢子排列为钻石状或正四面体状。

  六、注意事项

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  七、常见问题

在琼脂平板的表面,交配相反交配型的菌株可以构建成二倍体(patch mating)。 具体做法是:在琼脂平板(此平板应允许两种单倍体亲本的生长)上的一个0.5 cm直径的小圈中,用牙签分别挑新鲜亲本单倍体菌落,混杂在一起,于30℃交配4 h以上,然后将交配混合物划线在选择性平板上以选择二倍体基因型。


如果二倍体基因型无特别的选择标志(当单倍体亲本中的一种具有与二倍体相同的营养需要时),使用解剖显微镜从交配混合物中“拉出合子”,可达到分离二倍体的目的。交配4 h以后,在适合二倍体生长的平板上将交配混合物画几条平行线,使用解剖显微镜通过其典型的形态确认合子细胞,用分离针将它们挑出、与其他细胞分开,为了保证选择的细胞确实是二倍体,将它们接种在孢子形成平板上,经过适当条件培养后,在显微镜下检查四分体孢子的形成。也可采用另一种方法确认:用一对交配型实验菌株与选择出的细胞进行交配,在显微镜下检査每个实验株的合子形成情况,如果二倍体挑选正确,那么就不可能形成合子。




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