Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > 微生物学

微生物学

用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度实验

2024-05-09 微生物学 加入收藏
一、简介在制备新的病毒毒种贮液,或为蛋白质的生产和分析而进行感染时,了解毒种的滴度是非常重要的。 二、操作方法蚀斑试验法 三、原理空斑形成单位 (plaque

一、简介

在制备新的病毒毒种贮液,或为蛋白质的生产和分析而进行感染时,了解毒种的滴度是非常重要的。

 二、操作方法

蚀斑试验法


 三、原理

空斑形成单位 (plaque forming units, PFUs)试验,是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合,当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时,会造成细胞被溶解而形成空斑,每个空斑系由一个病毒颗粒所造成,计算空斑数目再乘以稀释倍数,即可得知原来的病毒感染单位的浓度。


病毒空斑(又叫蚀斑)如同噬菌体的噬斑,一个空斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做空斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法,将病毒各稀释度种入单层细胞瓶,吸附1 h 后,在单层细胞上覆以营养琼脂培养基,病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞,形成「空斑」的退化细胞区,经中性红活细胞染料着色后,活细胞显红色,而空斑区细胞已退化不着色,形成不染色区域。凡是能在细胞培养物中产生细胞病变效应 (Cytopathic Effect, CPE) 的病毒都可采用空斑技术来测定其滴度。

<link />

材料与仪器

病毒
台盼蓝
培养皿 培养箱

步骤

1. 用含10%胎牛血清的完全培养液稀释处于指数生长期的Sf9细胞至约5×106细胞/ml。在蚀斑试验之前几小时,以两个不同的密度将细胞种于60 mm 组织培养皿中。病毒毒种贮液的每--稀释度均设复孔,于27℃培养。



2. 如下用无血清完全培养液制成5 ml 的病毒贮液的系列稀释液:

(1)纯病毒毒种贮液:10-6、10-7、10-8稀释



(2)转染上清:10-4、10-5和10-6稀释


(3)单个蚀斑:10-1、10-2和10-3稀释

3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加1 ml 至各复孔中,于室温或27℃温育1 h,间断摇动以保证病毒和覆盖在细胞上的培养液均匀分布。



4. 温育30 min 后,准备琼脂糖顶层覆盖物。



5. 用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液,加入4 ml 琼脂糖覆盖物,让琼脂糖于室温固化10~20 min 。用Parafilm 膜封住毎个平板(以防干涸),于27℃ 培养4~8天。



6. 在蚀斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上,计数系列中的每一稀释度形成的烛斑数,计算病毒滴度。



7. 如果裸眼辨别蚀斑时遇到困难,则用台盼蓝染色。准备台盼蓝覆盖物,倾覆1 ml 至培养了3~5天、蚀斑形成较好的培养皿中。于27℃过夜温育培养皿,让染料扩散进入死细胞。计数蓝色蚀斑的数目并确定病毒滴度。


注意事项

<link />

常见问题

<link />



文章底部广告位

文章评论

加载中~