用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度实验
一、简介在制备新的病毒毒种贮液，或为蛋白质的生产和分析而进行感染时，了解毒种的滴度是非常重要的。 二、操作方法蚀斑试验法 三、原理空斑形成单位 (plaque
一、简介
在制备新的病毒毒种贮液，或为蛋白质的生产和分析而进行感染时，了解毒种的滴度是非常重要的。
二、操作方法
蚀斑试验法
三、原理
空斑形成单位 (plaque forming units, PFUs)试验，是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度。
病毒空斑（又叫蚀斑）如同噬菌体的噬斑，一个空斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做空斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1 h 后，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞，形成「空斑」的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而空斑区细胞已退化不着色，形成不染色区域。凡是能在细胞培养物中产生细胞病变效应 (Cytopathic Effect, CPE) 的病毒都可采用空斑技术来测定其滴度。
<link />材料与仪器
病毒
台盼蓝
培养皿 培养箱
台盼蓝
培养皿 培养箱
步骤
1. 用含10%胎牛血清的完全培养液稀释处于指数生长期的Sf9细胞至约5×106细胞/ml。在蚀斑试验之前几小时，以两个不同的密度将细胞种于60 mm 组织培养皿中。病毒毒种贮液的每--稀释度均设复孔，于27℃培养。
2. 如下用无血清完全培养液制成5 ml 的病毒贮液的系列稀释液：
（1）纯病毒毒种贮液：10-6、10-7、10-8稀释
（1）纯病毒毒种贮液：10-6、10-7、10-8稀释
（2）转染上清：10-4、10-5和10-6稀释
（3）单个蚀斑：10-1、10-2和10-3稀释
3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加1 ml 至各复孔中，于室温或27℃温育1 h，间断摇动以保证病毒和覆盖在细胞上的培养液均匀分布。
3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加1 ml 至各复孔中，于室温或27℃温育1 h，间断摇动以保证病毒和覆盖在细胞上的培养液均匀分布。
4. 温育30 min 后，准备琼脂糖顶层覆盖物。
5. 用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液，加入4 ml 琼脂糖覆盖物，让琼脂糖于室温固化10~20 min 。用Parafilm 膜封住毎个平板（以防干涸），于27℃ 培养4~8天。
6. 在蚀斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上，计数系列中的每一稀释度形成的烛斑数，计算病毒滴度。
7. 如果裸眼辨别蚀斑时遇到困难，则用台盼蓝染色。准备台盼蓝覆盖物，倾覆1 ml 至培养了3~5天、蚀斑形成较好的培养皿中。于27℃过夜温育培养皿，让染料扩散进入死细胞。计数蓝色蚀斑的数目并确定病毒滴度。
注意事项
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常见问题
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