杆状病毒毒种贮液的制备实验
一、简介杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80~180 kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。 二、操作方法杆状病
一、简介
杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80~180 kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。
二、操作方法
杆状病毒毒种贮液的制备实验
三、材料与仪器
杆状病毒
胎牛血清 重组病毒
培养箱 培养瓶 转子
步骤
从单层培养中制备：
1a. 以毎瓶1.8×107 Sf9细胞的密度，将细胞接种于两个150 cm2 培养瓶，在含10%胎牛血清的完全培养液中培养。于27℃让细胞贴壁3 h，然后移去完全培养液。以感染复数为0.1的病毒量，加入5 ml 含野生型或重组病毒的无血清完全培养液。于27℃温育1 h。
2a. 去掉病毒接种物，代之以20 ml 10%胎牛血清的完全培养液，于27℃温育1 h。每天在光学显微镜下检查细胞有无包涵体出现或细胞病变效应。
3a. 当大多数细胞含有包涵体或显示出细胞病变效应时（通常在感染后4至5天），收获病毒。将感染的培养物移入灭菌试管中，于4℃以1 000 g 离心10 min，将上清移至一新的灭菌试管，分别吸取1 ml 的小份上清移至几个螺口冻存管中，置液氮罐长期保存，将剩余的病毒毒种保存于4℃暗处。
从悬浮培养肀制备：
1b. 用50 ml 含10%胎牛血清的完全培养液在100 ml 旋转培养瓶中培养Sf9细胞，不停地振荡直到长至约2×106细胞/ml。于室温以1 000 g 离心10 min 回收细胞，弃去上清。以感染复数为0.1的病毒量，加入含野生型病毒或重组病毒的10~20 ml 无血清完全培养液重悬细胞团块。于室温培养1 h。
2b. 用含10%胎牛血清的完全培养液将体积加至100 ml 将细胞置于100 ml 旋转培养瓶中，于27℃培养3~4天，不停地振荡。
3b. 当大多数细胞含有包涵体或显示出细胞病变效应时，收获感染细胞，如步骤3a所述加以处理。
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