酵母菌基因克隆实验
一、简介用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。 二、操作方法互补法 三、
一、简介
用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。
二、操作方法
互补法
三、材料与仪器
酵母菌
步骤
1. 用含LEU 2作为选择标志的酵母菌DNA文库转化lea 2 cdc 101-1酵母菌株，在23℃培养，依据插入片段的大小，筛选2 000~20 000个Leu+转化体。
2. 影印平板转化体，将其转印到预热的选择性平板，并于37℃培养筛选互补温感突变的表型。过夜培养之后，含插入互补cdc 101-1突变基因片段的质粒的菌落以及含随机非互补质粒的潜在CDC 101+回复突变体均可能生长。 重新将平板上出现的每个单菌落划线并保存作进一步分析。
3. 用酵母菌候选株取得失去质粒的Leu- 菌株，观察它们在 37℃生长的能力，保留那些能含有质粒时才能在37℃生长的转化子。
4. 从步骤3中确认的转化酵母菌中提取总DNA，分别转化大肠杆菌，从而分离出质粒DNA。重新将质粒DNA转化到突变的酵母菌株中，并证实已分离到正确的质粒。
5. 通过限制性酶切图谱对质粒进行分析，确定出现在不同的质粒中的基因组DNA插入片段是否重叠。这种分析可能有助于确定该互补区的边界。构建不同的插入和缺失突变，检査它们在酵母菌突变株中互补突变的能力。这将为所克隆的插入片段之内部的基因定位提供更精确的信息。
5. 通过限制性酶切图谱对质粒进行分析，确定出现在不同的质粒中的基因组DNA插入片段是否重叠。这种分析可能有助于确定该互补区的边界。构建不同的插入和缺失突变，检査它们在酵母菌突变株中互补突变的能力。这将为所克隆的插入片段之内部的基因定位提供更精确的信息。
6. 将一个酵母选择性标志引入互补区中央的某一位点（基于步骤5获得的信息）。
7. 将被破坏的质粒再转化到原突变菌株中，并筛选突变表型，检查互补作用是否被彻底破坏。构建含一个野生型基因拷贝和一个被破坏基因拷贝的二倍体菌株。
8. 在孢子形成和剖分后，与含被破坏基因拷贝的单倍体孢子产物（通常靠步骤6引入的选择性标志来找出）与一个含原突变的菌株杂交，如果这个二倍体与原突变株表型相同，说明不存在互补作用，表明与突变相关的基因已被克隆，同时作一个对照实验，将含破坏基因的单倍体（也许它本身也可能表现非野生型表型）与一野生型孢子杂交，去说明这个二倍体表型是野生型的（表明破坏是一 种隐性突变）。
8. 在孢子形成和剖分后，与含被破坏基因拷贝的单倍体孢子产物（通常靠步骤6引入的选择性标志来找出）与一个含原突变的菌株杂交，如果这个二倍体与原突变株表型相同，说明不存在互补作用，表明与突变相关的基因已被克隆，同时作一个对照实验，将含破坏基因的单倍体（也许它本身也可能表现非野生型表型）与一野生型孢子杂交，去说明这个二倍体表型是野生型的（表明破坏是一 种隐性突变）。
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