酵母转化实验
一、简介转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现
一、简介
转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。
二、操作方法
原生质体转化
三、材料与仪器
酵母
YPD 山梨醇 CaCl 2-ME PEG 选择性再生琼脂
水浴锅 离心机 分光光度计 培养箱
YPD 山梨醇 CaCl 2-ME PEG 选择性再生琼脂
水浴锅 离心机 分光光度计 培养箱
步骤
1. 在实验前2天，将转化用酵母菌株的单菌落接种到5 ml YPD培养基中，于30℃培养过夜（如果酵母菌株是温度敏感的应在低温下培养）。
2. 转化前一天晚上，从5 ml 过夜培养液中取适量的菌液，接种于盛有50 ml YPD培养基的250 ml 无菌烧瓶中，再过夜培养，使细胞密度达到1~2×107细胞/ml（OD600=0.5~1.0，依据菌株的不同有一定的差别）。
2. 转化前一天晚上，从5 ml 过夜培养液中取适量的菌液，接种于盛有50 ml YPD培养基的250 ml 无菌烧瓶中，再过夜培养，使细胞密度达到1~2×107细胞/ml（OD600=0.5~1.0，依据菌株的不同有一定的差别）。
3. 室温下，1 100 g 离心5 min 沉淀细胞，细胞用10 ml 1mol/l 山梨醇溶液重悬，重复离心一次，细胞沉淀用5 ml 1 mol/l 山梨醇重悬。取适量的悬液用无菌超纯水作10-6稀释后取其中的0.1 ml 涂YPD平板，于30℃培养2天。
4. 将细胞悬液转移到50 ml 的烧瓶中，分别加入5 μl 2-巯基乙醇和150 μl Glusulase。于30℃缓缓地摇动温育约30~60 min，取适量无菌超纯水作10-3稀释后，从中取0.1 ml 涂布在YPD平板上，于30℃培养2天，
5. 将原生质体移到一个50 ml 圆底离心管中，室温下400 g 离心4 min。
6. 轻轻倒去上清，不要搅动细胞沉淀。加2 ml 1 mol/l 山梨醇，轻轻摇动液体重悬沉淀（沉淀细胞应该很容易离开管壁）。
7. 加入8 ml 1 mol/l 山梨醇溶液，以400 g 离心沉淀细胞，步骤6和7重复1次。
8. 重复步骤6，加入7 ml 1 mol/l 山梨醇和1 ml CaCl2溶液，轻轻混匀，400 g 离心4 min，细胞以1 ml 山梨醇/CaCl2溶液重悬。
8. 重复步骤6，加入7 ml 1 mol/l 山梨醇和1 ml CaCl2溶液，轻轻混匀，400 g 离心4 min，细胞以1 ml 山梨醇/CaCl2溶液重悬。
9. 往150~200 μl 细胞悬液中加入待转化的DNA（最多可达10 μg）和10 μl 担体DNA，室温下温育10 min。
10. 加10体积的PEG/CaCl2溶液，混匀，室温下静置10 min。
11. 以400 g 离心4 min 沉淀细胞。轻轻倒出含PEG的上清，细胞用0.5 ml 山梨醇/CaCl2溶液轻轻重悬，将悬液移至10 ml 已融化并保温于55℃水浴的再生琼脂中，在旋涡混合器上短促混匀，然后迅速倒在适当的CM省却成分培养基平板表面，转动平板进一步混合细胞和琼脂。
12. 于30℃（或其他适当的温度下）培养直到菌落出现，菌落会出现在再生琼脂的表面或琼脂中，挑单菌落，在同样的选择平板上划线。如果转化的目的是为了破坏基因组序列，那么应从几个转化体制备DNA，以便通过DNA杂交分析相关染色体的区域。
注意事项
1. 千万不要用漩涡混合器振荡或剧烈摇动原生质体。如果这些细胞沉淀不易重悬，应尽管缩短离心的时间和转速。
2. 加入DNA的体积不应超过细胞悬液体积的1/10，每一次转化应该转化一个只加担体DNA的对照，即可指示回复突变的频率。
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