差异显示 PCR（基本方法一）

差异显示PCR

差异显示PCR技术的基本原理是以不同来源的细胞或不同状态的同种细胞作为研究对象。 分别抽提各自的总RNA,然后以oligo-dT12 MN为锚定引物在反转录酶作用下将mRNA反转录 成cDNA,随后采用5/端的随机引物和3’端的oligo-dT12MN引物以及同位素标记的dNTP进行 PCR扩增反应。

所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后作放射自显影，对X光片上显示 的条带进行对比分析，从中可以找出差异表达的cDNA片段。从胶上切下这些表达差异的条带， 用相应的引物和条件进行PCR再扩增，克隆所得的PCR产物进行核昔酸序列分析，并在基因序 列数据库中作同源比较，即可知道是已知基因、还是未知基因。

器材：PCR仪、离心机、电泳仪

试剂：
①氯仿，异丙醇，75% 乙醇。
②无RNA酶的水或1 % SDS溶液［无RNA酶水配制：在无RNA酶的玻璃瓶中，配制 0.01% （体积分数）焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate, DEPC）水溶液，放置过夜后高压灭菌。并用该水配制SDS溶液］。
③RNase-Free DNase 和 RNase 抑制剂（RNase Inhibitor）。
④dNTP混合液
⑤TaqDNA聚合酶及其10×PCR缓冲液
⑥50 mol/L MgCl2
⑦3 mol/L 乙酸钠
⑧无水乙醇
⑨10 mg/ml糖原

差异显示PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）RNA的制备

下面以Introvigen公司的Trizol试剂提取总RNA方法为例。

(1) 材料处理
①组织:加入适量Trizol试剂(1ml Trizol试剂/50-100 mg组织)，搅匀。样本的体积不能超过加入的Trizol试剂体积的10%。
②单层细胞:在3.5 cm培养平皿中直接加入1 ml Trizol试剂，用移液枪打散混匀。
(2) 相分离：将混匀的样本在室温放置5 min, 使核蛋白复合体充分裂解。按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol试剂的比例加入适量氯仿，用力振荡15 s, 室温放置2~3 min。4 ℃，15000g 离心15 min，离心后混合物应该分成底部淡红色的氯仿层、中间相和上部无色的水相。水相的体积应该约占加入的Trizol试剂的60%。
(3) RNA提取：把水层转移到一个新的离心管中。按0.5 ml异丙醇/ 1 ml Trizol 试剂体系比例加入适量异丙醇。将样本在室温下放置10 min。4 ℃，12000 g 离心10 min。离心后可于离心管的底部或侧面观察到凝胶状RNA沉淀。
(4) RNA洗涤：弃除上清，在每1 ml Trizol试剂体系中加入1 ml 75% 乙醇，摇匀，充分洗涤RNA沉淀，4℃，7500 g离心5 min。
(5) RNA溶解：将沉淀空气干燥， 但注意不要过于干燥，否则不易溶解，导致A20/280<1.6。干燥后将沉淀溶于150 μl无RNase的水(DEPC水)中。
(6)去除DNA污染在反应管中加入下列试剂:
RNA 150 μl
RNase 抑制剂 1 μl
RNase-Free DNase(40U/μl) 4 μl
10×反应缓冲液[400mmol/L Tris-HCL(pH8.0)，100 mmol/L MgSO4, 10mmol/L CaCl2] 20 μl
无RNase的水 25 μl
混合均匀后，37 ℃温育30 min。

（二）模板RNA浓度的优化

(1) cDNA第一链的合成将浓度为1μg /μl的RNA稀释为0.1μg/μl和0. 01μg/μl两个浓度，以获得1μg、0.5μg、 0. 1pg、0. 05μug四个(或者更多) RNA梯度。在3'锚定引物库中选择一套简并引物，以不同浓度的RNA模板进行反转录反应。

首先在反应管中加入下列成分：

RNA模板 依梯度加入相应体积
dNTP混合液(10mmol/L) 1 μl
3'锚定引物 2 μl
无RNase的水 补至12 μl

65℃温育5min,迅速转人冰水中，加人下列成分:

5×first-strand缓冲液[ 250mmol/L Tris-HCI (pH8. 3)，375mmol/L KCl,15mmol/L MgCl2] 4 μl
0.1mol/L DTT 2 μl
RNase抑制剂 1 μl
混匀后，42 ℃保温2min,加入1 μl (200 U) SUPERSCRIPTⅡ混匀，42 °C继续反50 min,70 ℃加热15 min后取出- 20 ℃保存。

(2)取cDNA第一链产物，进行第二链合成和PCR扩增
在反应管中加入下列成分：
cDNA第一链产物 3 μl
3'锚定引物 2 μl
5'随机引物 2 μl
10X PCR缓冲液[ 200 mmol/L Tris-HCl (pH8. 4), 500 mmol/L KCl] 2 μl
dNTP混合液(10mmol/L) 1 μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5 μl
[α-33P]dATP或[α-35s]dATP(3000Ci/ mmol) 1 μl
MgCl2 (50 mmol/L)(如果PCR反应0.5 μl缓冲液中含有MgCl2 ,则不必添加) 0.5 μl
无RNase的水 补至 20 μl
如果所用PCR仪无加热盖，则需在反应管中滴加矿物油。

PCR反应条件:先94 ℃ 2 min; 然后94 ℃ 30 s，40℃ 30 s, 72 ℃延伸30 s，共10个循环；再94 ℃ 30 s，45 ss 530 s ，72 ℃延伸30 s，共25个循环；最后72 ℃延伸2 min。反应产物-20 ℃保存。

(3)凝胶电泳分析：现配制 DNA序列分析用的电解质梯度聚丙烯酰胺凝胶。每只PCR反应管中加5μl测序胶上样缓冲液，85 ℃水浴5 min后迅速转至冰水中，随后上样电泳分离。待指示剂二甲基蓝至凝胶长度2/3处结束电泳。

抽干凝胶，放射自显影底片下压片。一般理想的差异显示带型应可清晰分辨200左右条带，因此通过观察不同浓度来源RNART-PCR扩增反应产物的DNA条带，即可确定最适的RNA量(浓度)。 需要注意的是，凝胶浓度也会对结果产生一定的影响，在确定最适RNA量同时也应对凝胶浓度加以优化。

（三）DDRT-PCR

1. 根据不同的研究要求选择不同的引物组合

一般DDRT-PCR采用12个3’锚定引物和24个5'随机引物，但工作量极大：12个3’锚定引物，分别和24个5’随机引物反应，那么两个样品的差异显示共需作576个反应。如果重复则为1152个反应。同样，选择4套3’锚定简并引物，与24个5’随机引物，仍需作192个反应。

不过如果是初步试验以摸索条件或者鉴定新基因，可以减少分组，工作量也大大降低。例如釆用4组简并引物(T12MA、T12MT. T12MC和T12MG)或使用3组简并引物(T12GN、T12AN. T12CN),和8组5'随机引物反应。如3个3’锚定简并引物，与8个5’随机引物，只需要作48个反应即可。但除非是为了初步摸索条件或者鉴定新的基因，否则仍需使用完整的引物组分，以获得 较完整的表达基因谱。

2. 应用所选的引物组合和最适的RNA浓度进行DDRT-PCR反应
按前述步骤对扩增产物进行电泳分离和比较分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同样品来源而 采用相同的引物对的扩增产物应放在凝胶相邻的泳道上。

（四）差异条带的克隆、分析和鉴定

①将差异显示条带对应的胶条和滤纸用干净的刀片切下，置于微型离心管中，加100 μl水，室温放置30 min后沸水浴15 min，高速离心2 min,将上清转人新的管中。
②加人10 μl 3 mol/L乙酸钠、5 μl 10 mg/ml糖原，加400 μl无水乙醇，-70 ℃放置30 min。高速离心10 min,弃去上清，用500 μl 85% 乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥，溶于10 μl水中。
③用该DNA作模板，进行PCR扩增，在反应管中加人下列成分:
DNA 3 μl
相应3'引物 2 μl
相应5'引物 2 μl
dNTP混合(20mmol/L) 1 μl
10X PCR缓冲液[200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),

500 mmol/L KCI] 2 μl
TaqDNA聚合酶(5U/μl) 0.5 μl
MgCl2 (50 mmol/L) 0.5 μl
加水补至20 μl，并按下列条件进行PCR反应: 94 ℃ 2 min; 94 ℃30 s，42 ℃30 s，72 ℃30 s, 共30循环; 72 ℃ 2 min。
④取2 μl进行1% 琼脂糖凝胶电泳，估计PCR产物产量，并确定其大小是否与预期一致。
⑤将反应产物连人克隆载体，如Promega公司的pGEM T-easy载体。如果所用高保真Taq酶带有3'→5'外切酶活性，PCR产物无A末端，则需通过下列步骤获得带有dA尾的PCR反应产物:
PCR产物(建议纯化) 4 μl
10XPCR缓冲液[200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4), 500 mmol/L KCI] 1μl
不带有3'→5'外切酶活性的Taq酶 1 μl
MgCl (25 mmol/L) 1 μl
dATP(10 mmol/L) 2 μl
加水至10 μl,在70℃反应30 min.
⑥连接产物转化相应的宿主菌，挑取培养平皿上至少6个转化菌落，提取质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切分析。测定序列并对其进行比较分析，查询核酸数据库，确定是否为新的基因片段。
⑦利用NB杂交、RNase保护、定量PCR等方法对所获得的差异显示cDNA条带进行验证，建议使用一种以上的确证方法。