λ噬菌体的铺平板培养实验
原理噬菌斑起源于单个噬菌体颗粒对单个细菌的感染。第一次感染后合成的子代病毒颗粒吸附和感染邻近细菌，后者依次释放另一代子代病毒颗粒。如果细菌生长在半固体培养基（如
原理
噬菌斑起源于单个噬菌体颗粒对单个细菌的感染。第一次感染后合成的子代病毒颗粒吸附和感染邻近细菌，后者依次释放另一代子代病毒颗粒。如果细菌生长在半固体培养基（如含琼脂糖或琼脂）上，这种子代病毒颗粒的扩散是有限的。
材料与仪器
λ 噬菌体原种 大肠杆菌菌株
MgSO4 SM 和 SM+ 明胶
LB 或 NZCYM 琼脂平板 Sorvall SS-34 或相当型号 圆形滤纸 水浴
MgSO4 SM 和 SM+ 明胶
LB 或 NZCYM 琼脂平板 Sorvall SS-34 或相当型号 圆形滤纸 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
MgSO4 (10 mmol/L)，SM 和 SM+ 明胶
2. 培养基
LB 或 NZCYM（50 ml 分装于 250 ml 的圆锥瓶中）
LB 或 NZCYM 琼脂平板
LB 或 NZCYM 顶层琼脂或琼脂糖（0.7%）
3. 离心机和转子
Sorvall SS-34 或相当型号。
4. 专用设备
圆形滤纸（适用于培养皿）
加热设备或预置于 47℃ 的水浴
5. 载体和菌株
λ 噬菌体原种
大肠杆菌菌株
二、方法
铺平板细菌的制备
1. 接种适宜的大肠杆菌菌株的单菌落于 NZCYM 或 LB 培养基（50 ml 分装于 250 ml 锥形瓶）中，37℃ 中度振荡培养过夜。
一些方案推荐用 30℃ 培养而不是 37℃。低温生长将增加过夜培养细胞不能达到饱和状态的机会，这样减少了培养基中细胞碎片的量。正如早先提到的，噬菌体加入至饱和培养物中，会吸附到细胞碎片中的 LamB 蛋白上，因而减少了噬菌体培养物的滴度。
2. 室温，4000 g（或 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min，收集细胞。
3. 去上清，用 20 ml 10 mmol/L MgSO4 重新悬浮沉淀。测量 100 倍稀释后的 OD600 值，并进一步用 10 mmol/L MgSO4 将细胞悬浮液稀释至终浓度为 OD600 等于 2.0。
为了提高贮存过程中铺平板细菌的存活率，将细胞悬浮液置于 100 ml 的无菌烧瓶 37℃ 中度振荡培养 1 h。
4. 平板培养物的菌悬液于 4℃ 保存。
健壮的大肠杆菌菌液在 2~3 周后仍可用。但是，严重衰弱的大肠杆菌（如 recA- 菌株）在饥饿条件下于 4℃ 将快速失去存活能力。当用这类菌株进行 λ 噬菌体培养时需要新鲜的培养物。
5. 用微波炉进行短时间加热以熔化上层琼脂或琼脂糖。将熔化的琼脂或琼脂糖分装 ( 100 mm 的平皿 3 ml，200 mm 的平皿 7 ml )后，置于加热容器内或 47℃ 水浴中，以便使溶液保持熔化状态。
铺平板细菌的感染
6. 将噬菌体原种进行 10 倍系列稀释（于 SM+ 明胶中 )，用轻微涡旋振荡或轻拍试管一侧使各稀释度彻底混匀。
7. 从步骤 4 的铺平板细菌中取 0.1 ml 至一系列无菌试管中（13 或 17 X 100 mm）。
8. 在装有铺平板细菌的每个试管中依次加入 0.1 ml 各稀释度的噬菌体，经摇晃或轻微涡旋振荡混匀细菌和噬菌体。
9. 将混合物置 37℃ 温育 20 min，使噬菌体颗粒吸附到细菌上。将试管从水浴锅中挪出，使其冷却至室温。
10. 将一个分装管中的已熔琼脂或琼脂糖加入第一个试管中，用轻拍或涡旋振荡 5 s 进行混匀，立即将试管内的所有物质倾倒于一个标记好的琼脂平板的中央。要尽量避免产生气泡。轻轻地旋转平板使细菌和上层琼脂糖均匀地分布。重复这个操作，直到所有的试管中的物质都转移至分别标记好的平板中。
11. 将平板盖上盖，在室温放置 5 min，使上层的琼脂或琼脂糖凝固，最后将平板倒置于 37℃ 培养。
对一些大肠杆菌和噬菌体载体来说，平板于室温培养而非 37℃ 将形成更好的噬菌斑。比如，当用 Stretagene 公司的 SRBρ 和 SRB(P2)ρ 作宿主菌时，推荐使用 39℃ 作为温育温度。另外，当 λgt10 于 39℃ 培养时，将在大肠杆菌 hfl- 株中产生更好的噬菌斑。
12. 继续培养过夜，然后计算或筛选（挑取）单独的噬菌斑。
大约培养 7 h 后出现噬菌斑，12~16 h 后进行记数或挑取噬菌斑。此时，在健壮大肠杆菌中形成的噬菌斑的直径约为 2~3 mm。如果平板太干，噬菌斑将生长缓慢且不能达到其最大直径。新鲜制备的平板有不同的问题。在 37℃ 培养过程中，水蒸气会在顶层琼脂上形成水珠，使生长的噬菌斑因水珠的流动而相互污染。为了避免这一问题，用前可将平板在室温放置 2 d，或者半敞开盖子在层流柜或 37℃ 培养箱（效果稍差一点）中放置 2 h。如果急用，没有时间干燥平板，则等顶层琼脂凝固后除去平皿盖上的水珠，并在每个盖内加入一张圆形无菌滤纸。在 37℃ 倒置培养过程中，滤纸将吸收水蒸气，最大限度地减少噬菌斑的交叉污染。
有经验的话，噬菌斑可调整至合适的大小。比如，当用杂交筛选文库时，常希望限制噬菌斑的大小以便在每个平板中筛选到最大数量的噬菌体。从这个角度考虑，应该用时间比较久的平板，并加入比通常略多一些的细菌作菌苔。在其他条件下，如当使用衰弱的 red- gam- λ 噬菌体时，必须减少细菌的接种量和（或）用低浓度（0.6 %）的顶层琼脂或琼脂糖来获得适宜大小的噬菌斑。当菌苔长满而细胞达到稳定期后，λ 噬菌斑将不再增大。
1. 缓冲液和溶液
MgSO4 (10 mmol/L)，SM 和 SM+ 明胶
2. 培养基
LB 或 NZCYM（50 ml 分装于 250 ml 的圆锥瓶中）
LB 或 NZCYM 琼脂平板
LB 或 NZCYM 顶层琼脂或琼脂糖（0.7%）
3. 离心机和转子
Sorvall SS-34 或相当型号。
4. 专用设备
圆形滤纸（适用于培养皿）
加热设备或预置于 47℃ 的水浴
5. 载体和菌株
λ 噬菌体原种
大肠杆菌菌株
二、方法
铺平板细菌的制备
1. 接种适宜的大肠杆菌菌株的单菌落于 NZCYM 或 LB 培养基（50 ml 分装于 250 ml 锥形瓶）中，37℃ 中度振荡培养过夜。
一些方案推荐用 30℃ 培养而不是 37℃。低温生长将增加过夜培养细胞不能达到饱和状态的机会，这样减少了培养基中细胞碎片的量。正如早先提到的，噬菌体加入至饱和培养物中，会吸附到细胞碎片中的 LamB 蛋白上，因而减少了噬菌体培养物的滴度。
2. 室温，4000 g（或 5800 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min，收集细胞。
3. 去上清，用 20 ml 10 mmol/L MgSO4 重新悬浮沉淀。测量 100 倍稀释后的 OD600 值，并进一步用 10 mmol/L MgSO4 将细胞悬浮液稀释至终浓度为 OD600 等于 2.0。
为了提高贮存过程中铺平板细菌的存活率，将细胞悬浮液置于 100 ml 的无菌烧瓶 37℃ 中度振荡培养 1 h。
4. 平板培养物的菌悬液于 4℃ 保存。
健壮的大肠杆菌菌液在 2~3 周后仍可用。但是，严重衰弱的大肠杆菌（如 recA- 菌株）在饥饿条件下于 4℃ 将快速失去存活能力。当用这类菌株进行 λ 噬菌体培养时需要新鲜的培养物。
5. 用微波炉进行短时间加热以熔化上层琼脂或琼脂糖。将熔化的琼脂或琼脂糖分装 ( 100 mm 的平皿 3 ml，200 mm 的平皿 7 ml )后，置于加热容器内或 47℃ 水浴中，以便使溶液保持熔化状态。
铺平板细菌的感染
6. 将噬菌体原种进行 10 倍系列稀释（于 SM+ 明胶中 )，用轻微涡旋振荡或轻拍试管一侧使各稀释度彻底混匀。
7. 从步骤 4 的铺平板细菌中取 0.1 ml 至一系列无菌试管中（13 或 17 X 100 mm）。
8. 在装有铺平板细菌的每个试管中依次加入 0.1 ml 各稀释度的噬菌体，经摇晃或轻微涡旋振荡混匀细菌和噬菌体。
9. 将混合物置 37℃ 温育 20 min，使噬菌体颗粒吸附到细菌上。将试管从水浴锅中挪出，使其冷却至室温。
10. 将一个分装管中的已熔琼脂或琼脂糖加入第一个试管中，用轻拍或涡旋振荡 5 s 进行混匀，立即将试管内的所有物质倾倒于一个标记好的琼脂平板的中央。要尽量避免产生气泡。轻轻地旋转平板使细菌和上层琼脂糖均匀地分布。重复这个操作，直到所有的试管中的物质都转移至分别标记好的平板中。
11. 将平板盖上盖，在室温放置 5 min，使上层的琼脂或琼脂糖凝固，最后将平板倒置于 37℃ 培养。
对一些大肠杆菌和噬菌体载体来说，平板于室温培养而非 37℃ 将形成更好的噬菌斑。比如，当用 Stretagene 公司的 SRBρ 和 SRB(P2)ρ 作宿主菌时，推荐使用 39℃ 作为温育温度。另外，当 λgt10 于 39℃ 培养时，将在大肠杆菌 hfl- 株中产生更好的噬菌斑。
12. 继续培养过夜，然后计算或筛选（挑取）单独的噬菌斑。
大约培养 7 h 后出现噬菌斑，12~16 h 后进行记数或挑取噬菌斑。此时，在健壮大肠杆菌中形成的噬菌斑的直径约为 2~3 mm。如果平板太干，噬菌斑将生长缓慢且不能达到其最大直径。新鲜制备的平板有不同的问题。在 37℃ 培养过程中，水蒸气会在顶层琼脂上形成水珠，使生长的噬菌斑因水珠的流动而相互污染。为了避免这一问题，用前可将平板在室温放置 2 d，或者半敞开盖子在层流柜或 37℃ 培养箱（效果稍差一点）中放置 2 h。如果急用，没有时间干燥平板，则等顶层琼脂凝固后除去平皿盖上的水珠，并在每个盖内加入一张圆形无菌滤纸。在 37℃ 倒置培养过程中，滤纸将吸收水蒸气，最大限度地减少噬菌斑的交叉污染。
有经验的话，噬菌斑可调整至合适的大小。比如，当用杂交筛选文库时，常希望限制噬菌斑的大小以便在每个平板中筛选到最大数量的噬菌体。从这个角度考虑，应该用时间比较久的平板，并加入比通常略多一些的细菌作菌苔。在其他条件下，如当使用衰弱的 red- gam- λ 噬菌体时，必须减少细菌的接种量和（或）用低浓度（0.6 %）的顶层琼脂或琼脂糖来获得适宜大小的噬菌斑。当菌苔长满而细胞达到稳定期后，λ 噬菌斑将不再增大。
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