简并寡核苷酸诱变实验（小段DNA序列中产生大量突变）

6.  加2 μl 2.5 mmol/l 4种dNTP混合液，5 U klenow酶，再加10 μCi的任意一种［α-32P］，23℃保温1 h。另加入5 U的klenow酶继续温育2 h或过夜。

 

7.  加1 μl 0.5 mol/l EDTA终止反应，加TE缓冲液至总体积为50 μl，加乙酸钠至终浓度为0.3 mol/l。用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀DNA。DNA重悬于20 μl TE缓冲液。取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析之用。
 

8.  在30 μl 反应体积内，每微克塞核苷联用10~40 U 的识别外侧限制性酶切位点的酶消化双链寡核苷酸2 h 以上，如寡核苷酸5’端无限制性内切酶位点，则用识别内侧限制性内切酶位点的酶切割。

 

9.  取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，余下的用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀，在重悬于不少于10 μl 的TE缓冲液，然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

 

10.  切下双链DNA所在的胶，并用凝胶洗脱缓冲液将其洗脱出来，用20 μl 的TE缓冲液重悬，贮存于-20℃。

11.  用识别内侧酶切位点（位于原来的寡核苷酸的3’端）的限制性内切酶消化双链寡核苷酸，以生成一同源双链寡核苷酸混合物，其5’和3’端适于将它们连接进常规的的载体中去。取留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，剩余的用酚抽提， 乙醇沉淀，重悬于20 μl  缓冲液。

12.  步驟7、9、11中留取的2 μl 液体用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以证实各步反应均产生了所要的产物。

13.  按系列稀释法用TE缓冲液从10到10 000倍系列稀释双链寡核苷酜，设置一系列的连接反应，每个反应均含有恒量的载体和部分上述稀释液。

14.  用常规的转化方法将连接反应物转化进适当的大肠杆菌。通过限制性内切酶酶切和DNA序列测定来分析所得的DNA。