流式细胞方案

为最大程度的保证实验结果，我们推荐客户严格遵循 CST 的实验操作方法，这些实验方法经过 CST 科学家的反复验证，能够保证实验结果的精确性和可重复性。

流式细胞术方案

A. 所需溶液和试剂

1. 1X 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 8 g 氯化钠（NaCl），0.2 g 氯化钾（KCl），1.44 g 磷酸氢二钠（Na2 HPO4），0.24 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）溶解在 800 ml 蒸馏水（dH2O）中。用盐酸调节 pH 到 7.4，定容至 1 升。室温保存。

2. 甲醛溶液（无甲醇的）。

3. 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶解在 100 ml 的 1 X PBS 中。保存在 4°C。

B. 固定

1. 离心收集细胞，弃上清。

2. 将细胞重悬在 0.5-1 ml PBS 中。加入甲醛溶液至终浓度为 2-4%。

3. 37°C 固定 10 分钟。

4. 放在冰上降温 1 分钟。

5. 做细胞外染色不需要细胞膜打孔时，继续 D1 步或将细胞保存在 4°C 含有 0.1% 叠氮钠的 PBS 中；做细胞内染色时，继续 C1 步给细胞膜打孔。

C. 细胞膜打孔

1. 边轻轻震荡边将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入到预冷的细胞中，至终浓度为 90%。或者也可以在细胞膜打孔前离心去除固定剂，然后将细胞沉淀重悬在 90% 甲醇 PBS 溶液中。

2. 在冰上放置 30 分钟。

3. 进入染色步骤或是将细胞在 90% 甲醇 PBS 溶液中，-20°C 保存。

D. 免疫染色

注意：单克隆抗体设立相应亚型的对照，而多克隆抗体需要对应种属的 IgG 作为对照。用血球计数法或是其他方法对细胞计数。

1. 将 0.5-1 x 106 个细胞分到各检测管中（依照体积）。

2. 各管加入 2-3 ml 孵育缓冲液漂洗，离心回收细胞。重复一次。

3. 将每个管中的细胞重悬在 100 µl 孵育缓冲液中。

4. 室温，孵育缓冲液封闭 10 分钟。

5. 按合适的稀释比例在检测管中加入未标记，生物素标记或是荧光素标记的一抗。具体的用量参考抗体各自的说明书。

6. 室温孵育 1 小时。

7. 同第二步，用孵育缓冲液清洗，离心回收细胞。

8. 如果是荧光素标记的一抗，则将细胞重悬在 0.5 ml PBS 中然后用流式细胞仪检测。如果是未标记或者生物素标记的一抗，则继续 D9 步。

9. 用孵育缓冲液按推荐比例稀释荧光素标记的二抗或抗生物素蛋白 avidin，将细胞重悬在该稀释液中。

10. 室温孵育 30 分钟。离心去除稀释液。

11. 同第二步，用孵育缓冲液清洗，离心回收细胞。

12. 将细胞重悬在 0.5 ml PBS 中然后用流式细胞仪检测。或者继续 E1 步 DNA 染色。

E. DNA 染色（可选）

1. 将细胞重悬在 0.5 ml DNA 染色液中（例如 DRAQ5® #4084）。

2. 室温至少孵育 5 分钟。

3. 流式细胞仪进行分析。

☀ 推荐的二抗：

抗兔：

 Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 488 Conjugate）#4412

 Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 555 Conjugate）#4413

 Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 647 Conjugate）#4414

抗小鼠：

 Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 488 Conjugate）#4408

 Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 555 Conjugate）#4409

 Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 647 Conjugate）#4410

抗大鼠：

 Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor® 488 Conjugate）#4416

 Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor® 555 Conjugate）#4417

 Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor® 647 Conjugate）#4418