羊膜腔接种

羊膜腔接种主要应用于从临床材料中（如患者咽嗽液等）分离流感病毒等操作。这种接种途径可直接感染羊膜腔的内胚层，也可被鸡胚咽下或吸入，引起全胚胎感染。另外，病毒也可被排泄到尿囊腔中，使尿囊液中含有大量病毒。因此，在用羊膜腔接种分离病毒时，除可收获羊水以外，还可收获尿囊液。

鸡胚接种技术的原理是用病毒（如牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus））接种鸡胚。 牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。 鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的 动物病毒 的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。

器材：

①孵卵箱

②检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器

③注射器

④眼科用剪刀和摄子、酒精灯和毛细吸管

试剂：

①材料：受精鸡卵最好选择健康来亨鸡受精卵，因为来亨鸡的卵壳洁白易于照视观察，如无此卵也可选择其他受精鸡卵。用于病毒培养的受精鸡胚，最好是来自无特定病原体鸡群 。

②消毒剂（2.5％ 碘酒和 75% 酒精）

③2％ 来苏儿液

羊膜腔接种的基本过程可分为如下几步：

( 1 ) 接种步骤与方法

1 ) 将 10- 12 日龄的鸡胚在检卵灯上照视，划出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

2 ) 用 2.5％ 碘酒及 75％ 酒精分别消毒气室部位的蛋壳，并用开孔器在气室顶端钻出一约 10 mmx6 mm 的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜 。

3) 用 2.5％ 碘酒再次消毒钻孔区后，用灭菌的眼科小摄子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液状石蜡一滴于下层壳膜上使其透明，以便观察胚胎的位置。

4) 将注射器刺向胚胎的腾下胸前，以针头拨动下颗及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入 0.1 -0.2 mL 病毒液。

5 ) 拔出针头，孔区先用 2. 5％ 碘酒消毒，然后用沾有碟酒通过火焰的小块胶布将卵壳的小窗口封住，并于 33-35 ℃ 孵卵器内孵育 48~72 小时，此过程要保待鸡胚的气室朝上 。

(2) 解剖与收获

1) 收获前鸡胚须置 4 ℃ 冰箱 6 小时或过夜，但不能放置时间过长（过长会引起散黄）。如急于收获亦可置－20 ℃ 冰箱 1 小时左右。预冷的目的是将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液中的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。

2) 用 2.5％ 碘酒和 75％ 酒精分别消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳，此时勿使其碎片落于未损伤的壳膜上。用无菌毛细吸管吸取尿粪液，然后左手持小摄子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获 0.5-1.0 mJ羊水。

3) 病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿搅液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。

1. 防止污染 为了减少污染，整个过程均需无菌操作，否则鸡胚一经污染，即迅速死亡或影响病毒的培养 。

2. 适宜的培养温度 接种过的鸡胚，应根据实验病原繁殖所需温度，放入 33~37 °C 温箱内培养 。