绒毛尿囊膜接种

绒毛尿囊膜接种常用于牛症病毒、天花病毒、单纯疤疹病毒的分离，因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痉疤状病灶。另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，因为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和疮的数目来计算。该方法还可用于抗病毒血清的滴定试验，即在有抗体存在的情况下，疮疤形成受到抑制。

鸡胚接种技术的原理是用病毒（如牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus））接种鸡胚。 牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。 鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的 动物病毒 的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。

器材：

①孵卵箱

②检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器

③注射器

④眼科用剪刀和摄子、酒精灯和毛细吸管

试剂：

①材料：受精鸡卵最好选择健康来亨鸡受精卵，因为来亨鸡的卵壳洁白易于照视观察，如无此卵也可选择其他受精鸡卵。用于病毒培养的受精鸡胚，最好是来自无特定病原体鸡群 。

②消毒剂（2.5％ 碘酒和 75% 酒精）

③2％ 来苏儿液

绒毛尿囊膜接种的基本过程可分为如下几步：

(1) 接种步骤与方法

1) 将孵育 10~13 日龄的鸡胚放在检卵灯上，用铅笔画出气室、胎位，并于与胚胎略近气室端的绒毛尿袭膜发育较好的卵壳上画一等边三角形，每边 10 mm。

2) 用碳酒消毒气室顶端及绒毛尿囊膜记号处，并用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。

3) 用小锻子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵壳膜纤维方向小心地划破一隙，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿痪膜。

4) 用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，造成负压，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。

5) 用注射器通过卵壳的窗口滴 0.05~0.10 mL 病毒液于绒毛尿痪膜上，然后将鸡胚轻轻地旋转使接种物扩散到人工气室之下的整个绒毛膜尿袭膜上。

6) 在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即用消毒胶布封口。也可用揭下的卵壳封口，即将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡胚始终保持人工气室在上方的位置，33~35 ℃ 继续培养 48~72 小时。

(2) 解剖与收获

1) 用 2.5％ 碘酒和 75％ 酒精分别消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的胶布。

2) 将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去卵壳及壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科摄子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用 50％ 甘油保存。同时作无菌培养。

1. 防止污染 为了减少污染，整个过程均需无菌操作，否则鸡胚一经污染，即迅速死亡或影响病毒的培养 。

2. 适宜的培养温度 接种过的鸡胚，应根据实验病原繁殖所需温度，放入 33~37 °C 温箱内培养 。