质粒的酵母直接转化

2024-05-10 微生物学加入收藏

原理将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转

原理

将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中

材料与仪器

单菌落
PLATE溶液载体DNA 转化质粒DNA
离心管离心机

步骤

1、用牙签从平板中挑取单菌落（直径2～3mm），转移到1.5ml的无菌离心管中。

2、将10μl载体DNA（100μg）与10μl转化质粒DNA混合，振荡均匀。（若转化DNA是用未经RNA酶处理的“mini－prep DNA”方法制得，则不需加载体DNA）。

3、加0.5ml PLATE溶液，振荡。

4、置于实验台上，室温培养4天。

5、置42℃下热激15分钟。

6、以8000～10000r/min离心10秒沉淀细胞，小心弃去上清液，将细胞轻轻悬浮到200μl无菌蒸馏水，使细胞悬浮均匀，再直接将混合液涂选择平板。

注意事项

严格按照顺序加入试剂

常见问题

在酵母菌、脉孢菌和植物细胞中转化的主要障碍是细胞壁。把细胞壁用酶消化后便能有效地转化。

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