从酵母细胞中分离质粒
一、简介利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在3
一、简介
利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突变的酵母菌基因。分离到温度不敏感菌落后，必须采取两个步骤来证明在这种转化到cdc101-1菌株中的质粒含有野生型cdc101基因。第一步，假如这种观察到的互补现象是由质粒引起的，而非cdc101-1回复突变造成，互补质粒的分离必定导致质粒所带的选择标志及互补表型同时消失。第二步，必须排除是否被克隆的基因编码了这种突变的表型抑制基因的情形，而非野生型基因编码。这些均可通过互补实验来实现，并且可证明一个整合到基因组中的克隆基因的破坏是否能够互补原有的突变。
二、操作方法
从酵母细胞中分离质粒
三、原理
在非选择性生长条件下，大多数大肠杆菌/酵母菌穿梭载体的丢失频率大约1%。 在本方案中含质粒的酵母菌株接种于非选择性平板上以分离质粒并可得到单菌落。然后通过影印到选择性平板上可以鉴别丢失了质粒的菌株
四、材料与仪器
含质粒的酵母菌株
YPD或其他非选择性液体培养基及平板 CM缺失成分平板
灭菌绒布及影印模板
YPD或其他非选择性液体培养基及平板 CM缺失成分平板
灭菌绒布及影印模板
五、步骤
1) 挑取几个含质粒的酵母菌单克隆，分别接种于10 mL非选择性培养基，30℃培养过夜。如果没有其他的选择，可以用YPD培养基，如果要保留其他不稳定遗传标志或质粒，可以用添加了与可能丢失的可选择标志相应的营养成分的确定成分培养基。
2) 涂布在相应的非选择性平板上以得到单菌落，30℃培养2天。
3) 影印到选择性平板上以确定丢失了质粒选择标志的菌落。将选择性平板和非选择性主平板置30℃培养过夜。
六、注意事项
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七、常见问题
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