环介导等温扩增技术在动物学中的应用

环介导等温扩增技术在动物学中的应用是一种新的核酸等温扩增方法，是利用 4 个特殊设计的引物和具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在恒温条件下特异，高效，快速地扩增 DNA 的新技术。

环介导等温扩增技术的基本原理是 DNA 在 65 ℃ 左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。基于 DNA 的上述特性，Notomi 于 2000 年首次报道了型核酸扩增方法——LAMP。首先，在链置换型 DNA 聚合酶的作用下，内引物 FIP 与模板 DNA 结合，合成互补链；随后，新合成链在外引物 F3 的作用下被置换，而被置换的单链在 5' 末端存在互补的 F1c 和 F1 区段，于是形成环状结构。然后，内引物 BIP 与该单链结合，在延伸过程中同时打开环状结构，形成双链 DNA。最后，外引物 B3 与该双链 DNA 的 B3c 结合，随着引物 B3 的不断延伸，两侧分别为 FIB 和 BIP 的完整单链被置换。由于该单链两端存在互补序列，于是形成「哑铃状」结构。该结构是 LAMP 法基因扩增循环的起始结构。

LAMP 法基因扩增循环：在哑铃状结构中，以 3' 端的 F1 区段为起点，以自身为模板，进行 DNA 合成延伸。与此同时，FIP 引物上的 F2 与环上单链 F2c 结合，启动新一轮链置换反应，使 F1 区段新合成的链解离，解离出的单链再形成环状结构。该环状结构一方面以 B1 为引物进行延伸，使 F2 合成链解离（解离链进而形成哑铃状结构，重复上述过程）；另一方面，BIP 引物上的 B2 与环上的 B2c 结合，启动新一轮扩增。再经过链解离、环状结构形成、环状结构自身扩增、单链置换等周而复始过程，最后形成大小不一的梯度结构。此外，在反应过程中产生大量的焦磷酸，与镁离子结合形成白色沉淀——焦磷酸镁，肉眼观察液体的浑浊变化，即可判定反应是否发生。反转录 LAMP（RT-LAMP）是基于 LAMP 建立的 RNA 分子检测技术，其灵敏度是 RT-PCR 的 100 倍。RT-LAMP 扩增原理与 LAMP 相同，但在反应体系中增加了反转录试剂，使 RNA 的反转录和 cDNA 的 LAMP 扩增在同一试管中完成，而不需要分步进行。

图解示意：

环介导等温扩增技术可用于：

1. 病原体检测（包括病毒、细菌、真菌、支原体、寄生虫等）

2. 动物胚胎性别鉴定。

器材：

水浴锅、电泳仪

试剂：

① Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs）

② 溴化乙锭（EB）

③ SYBR Green 染色液

④ Tris-HCl

⑤ EDTA

⑥ NaCl

⑦ SDS

⑧ Betaine（甜菜碱，5 mol/L）购自 Sigma 公司；

⑨ AMV 反转录酶购自 Sigma 公司；

⑩ PCR 反应试剂购自 Takara 公司；

⑪ 10 × ThermoPol 缓冲液；

⑫ 琼脂糖

环介导等温扩增技术在动物学中的应用基本过程可分为如下几步：

1、模板制备

(1)DNA 的提取取组织匀浆液 100μl 加入 20μl 的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；1 mmol/L EDTA；15 mmol/L NaCl；0.5% SDS），振荡混匀后，煮沸 10 min，最后 12000 r/min 4 ℃ 离心 10 min，取上清作为模板，进行 LAMP。

(2)RNA 的提取参照 Trizol Reagent（Invitrogen 公司）的说明书，从组织样品中抽提

RNA，最后将核酸沉淀于 DEPC 处理过的双蒸水中，-70 ℃ 保存作为 LAMP 扩增的模板。

2、引物的设计

根据 GenBank 公布的目的基因序列，选择其中的保守区，运用 Primer Explorer Version 3 设计两套特异性引物，即类似于引物示意图中的（F3 和 FIP、BIP 和 B3）。由于在 LAMP 扩增起始阶段需要 4 条引物结合到靶 DNA. 上，所以要对引物的序列及大小进行选择，以便它们的融合温度都在一定范围内。内引物（FIP 和 BIP）的 Tm 值应高于外引物（F3 和 B3）的 Tm 值，并且扩增片段在 300 bp 内。

3、反应体系

(1)LAMP 反应体系（25 μl）

dNTP 1.4 mmol/L 5 μl、FIP/BIP 20 umol/L 2μl、F3/B3 5 μmol/L 0.5 μl、Betaine 5 mol/L 5 μl、MgCl2 5 mmol/L 2.5μl、Bst DNA 聚合酶大片段 2 μl、10 × ThermoPol 缓冲液 2.5 μl、DNA 模板 1~5 μg，加双蒸水补足至 25 μl；混匀后 60~65 ℃ 温浴 1 h，85 ℃ 灭活 5 min。

(2)RT-LAMP 反应体系（25 μl）

AMV 0.5 μl；RNasin Ri-bonuclease Inhibitor 0.5 μl；10 × ThermoPol 缓冲液 2.5 μl；MgCl2 25 mmol/L 2.5 μl；dNTP 1.4 mmol/L 5 μl；Bst DNA 聚合酶大片段 2 μl；FIP/BIP 20 μmol/L 2 μl、F3/B3 5 μmol/L 0.5 μl；模板 DNA 2 μg；Betaine 5mol/L 5 μl；DEPC 水补足至 25 μl；混匀后 60~65 ℃ 温浴 1 h，85 ℃ 灭活 5 min。

4、结果分析

(1) 肉眼观察

在 LAMP 反应结束后，可以直接用肉眼观察反应管底部是否有白色沉淀（焦磷酸镁）产生，如反应管中出现沉淀，说明发生了扩增反应，即样品中有目的基因存在。

（2）琼脂糖凝胶电泳

LAMP 反应的最终扩增产物是茎环 DNA 组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，可将扩增产物于 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳图为典型的梯状条带。

（3）荧光染料检测

在扩增产物中加入能掺入到双链 DNA 中的荧光染料 SYBY GreenⅠ，在紫外灯或日光下通过肉眼进行扩增结果判定。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I 的橙色不变，并且荧光强度与扩增产物的量成正比。

（4）浊度仪进行检测

日本荣研株式会社利用 LAMP 反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀，研制出专门用于 LAMP 检测的实时终点浊度仪，以实现对 LAMP 扩增过程的实时监控，使扩增和检测同时完成。

1. 引物浓度

引物浓度对 LAMP 的影响包括内引物和外引物两个方面，起主要作用的是内引物，外引物浓度相对影响不大。内外引物浓度的比例最适为（6:1）~(10:1)，这个范围内都能取得很好的扩增效果。外引物在反应体系中的终浓度达到 0.2 μmol/L 以上后，对反应效率就几乎没有提高；内引物的终浓度在 1.6~2.4 μmol/L 这个范围内效果最好，超过 3.0 μmol/L 时，会抑制反应。

2. 温度

温度影响 LAMP 的方式与在 PCR 中不同，它不是作用于 DNA 而是作用于 Bst 酶。实际上当温度降到 58 ℃，反应仍能进行。只是此时酶的活性很弱，反应效率极低。在 Bst 酶活性范围内（60~65 ℃），温度对 LAMP 的影响不大。

3. 其它因素

甜菜碱及其它减少碱基堆积的化学物质如 L-脯氨酸也能影响 LAMP 的效率，不过它们同外引物一样，只是辅助作用，当浓度达到一定程度便没有影响了，起决定性的还是内引物，或者更确切地说内引物与模板的结合速率。Bst 酶自然也是影响反应速率的关键，但通常所用 8 U 的酶（25 μl 体系）已经完全满足了合成的需要，提高其浓度对扩增效率没有太大促进作用。