以硅膜为基础分离基因组 DNA 实验

PBS Na2 HP04 KH2PO4 NaCl KC1 消化液 MasterMix 蛋白酶 K
自动定位器 P250 盒装吸头 平板密封条 Vac-Man96 真空装置 真空泵

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

1XPBS(用于组织培养细胞）

将下列试剂溶解于1L消毒的去离子水中，高压灭菌。1XPBS的pH应为7.4。

Na2HP04 1.15g

KH2P4 0.2g

NaCl 8g

KC1 0.2g

2.酶和酶缓冲液

（1）消化液MasterMix(用于组织和小鼠尾）

每个组织样品应与下述成分混合。

核裂解液 200ul

EDTA(0.5mol/L) 50ul

蛋白酶K(20mg/ml) 20ul

RNA酶A溶液（4mg/ml) 5ul

（2）蛋白酶K(20mg/ml溶液；用于组织和小鼠尾）

用无核酸酶的水重悬蛋白酶K至浓度为20mg/ml,然后根据一次预处理的平均样品数量将其按工作体积进行分装。-20°C储存，使用前在冰上融化，要避免多次冻融。

3.特殊设备

3台单位置的实验用自动定位器（BeckmanCoulter)

4套P250盒装吸头（BeckmanCoulter)

4X4位实验用自动定位器（BeckmanCoulter)

96孔吸头洗漆自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

黏性平板密封条（金属箔制成的）

加热和冷却自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

液体处理自动机械（用于自动程序），如BiomekFx或Biomek2000实验自动工作平台(BeckmanCoulter)

回旋振荡式自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

吸头装卸自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

Vac-Man96真空装置（Promega)

能产生15~20in(lin=2.54cm)汞柱压力的真空泵

真空废物收集装置（1L规格）

真空管

水浴，55°C

4.其他

WiZardSV96基因组DNA纯化系统（Promega;该系统包括结合扳、96孔深孔板、DNA洗脱板、核裂解溶液、0.5mol/L EDTA、Wizard SV裂解缓冲液、WizardSV洗涤液、RNA酶A溶液和无核酸酶的水）

5.细胞和组织

用于基因组DNA纯化的样品（小鼠尾剪取物、动物组织或组织培养细胞）

二、方法

1.用于自动纯化DNA的小鼠尾样品和组织裂解液的准备

（1）将一个0.5~1.2cm长的小鼠尾剪取物或20mg的其他组织置于96孔深孔板的每孔中。20mg组织是允许的最大样品量，超过此置可能导致纯化过程中SV96结合扳充塞8

（2）每个样品加入275ulMasterMix消化液后，用黏性密封条封上板。

（3）将该板置于55°C水浴中温育过夜（16~18h)。

如果在蛋白酶K过夜消化后不立即逬行基因组DNA的纯化，则可以将样品裂解液冻于-70°C储存。

在对基因组DNA进行自动纯化操作前，必须将冰冻的裂解液升溫到55°C且保持lh。

可选：如蛋白酶过夜消化后仍有未消化的毛发和软骨残存，可以在2000g下离心该96孔板来沉降未消化的样品，然后将上清液转移到一个新96孔深孔板中。

2.从组织裂解液中自动纯化基因组DNA

样品组织由蛋白酶K消化后，接下来的所有基因组DNA纯化步骤都可以在一个液体处理工作平台中自动进行。把需要的工具、试剂和溫育的组织裂解液板放置于自动液体处理器的工作台上后，将自动进行以下操作。

（1）每个样品孔中加入250ul Wizard SV裂解缓冲液。

（2）抽吸数次以混合各孔内的成分。

（3）将组织裂解液转移到置于其空装置中的结合板的孔内，通过抽其空使所有裂解液过结合板以使基因组DNA结合到板上。

（4）向每个结合板的孔内加入1ml Wizard SV洗涤液。

（5）通过抽真空使洗涤液通过结合板。

（6）重复步骤（4）和（5）以使总洗涤次数达到3次。

（7）在滤孔抽空后，继续抽真空6min以干燥结合基质。

（8）准备其空装置组装器以进行洗脱。取出其空装置内的结合板，放入一个深孔洗脱板,然后将结合板以相同的方向置于洗脱板上，这样结合板的尖端就位于深孔洗脱板的中央。

（9）向结合板的每个孔中加入200ul无核酸酶的水（室温），且在室溫下温育2min。

（10）抽真空lmin将已纯化的基因组DNA从SV96结合板中洗脱到96孔深孔板中。

（11）重复步骤（9）、（10）使总洗脱体积达到400ul。

（12）基因组DMA纯化结束，纯化好的样品在96孔深孔板中。用平板密封条封好板后，样品可在-20°C或-70°C储存。

3. 从组织培养细胞中自动纯化基因组 DNA

下面的程序用于从 96 孔培养板中培养的组织培养细胞中自动纯化基因组 DNA。每个孔

最多可以纯化 5X106 个细胞，如果每孔中细胞的数量超过这个值就可能会引起纯化过程中 SV96 结合板的充塞。细胞数目可以根据细胞类型和功能进行调整。

（1）自动纯化前要用消毒的 1XPBS 对细胞进行一次洗涤，随后的所有步骤都可以在一

个液体处理工作平台中自动进行。把需要的工具、试剂和细胞（无介质或 PBS) 置于自动液体处理器的工作台上后，将自动进行以下操作。

（2）向已洗涤的细胞中加入 150ul WizardSV 裂解缓冲液，抽吸混匀。

如果基因组 DNA 不立即进行纯化，可在加入 WizardSV 裂解缓冲液后伴止该步的进行，样品可储存于-70°C。将样品裂解产物融化后，可按照步骤（3）继续进行基因组 DNA 的纯化。

（3）转移细胞裂解液到其空装置中的结合板内，通过抽真空使洗涤液通过结合板，从而

将基因组 DNA 结合到结合基质上。

（4）向结合板的每个孔中加入 lml 洗涤液，抽真空使洗涤液通过结合板。

(5)重复步輾(4)两次，使洗涤的次数达到3次。

(6)在滤孔抽空后，继续抽真空6min以干燥结合基质。

(7)准备真空装置用于洗脱。取出结合板，在真空装置中放入一个深孔洗脱板，然后将结合板以相同方向置于洗脱板顶上，使结合板尖端位于深孔洗脱板中央。

(8)向结合板的每个孔中加入200ul无核酸酶的水（室温），室温下温育2min。

(9)抽真空lmin使已纯化的基因组DNA从SV96结合板中洗脱到96孔深孔板中。

(10)基因组DNA纯化结束，纯化好的样品在96孔深孔板中。用平板密封条封板，样品可在-20°C或-70°C储存。
RNA可能与基因组DNA—起被纯化出来。为除去纯化出的RNA,在由滤柱中洗脱基因组DNA前应该向250ul无核酸酶的水中加入2ulRNA酶A溶液。洗脱后，室溫下将已纯化的基因组DNA温育l0min。或者也可以在洗脱后加RNA酶A溶液（2ul)。

4.分离DNA的定性和定量

WizardSV纯化样品的产量和质量可以通过用分光光度计对A260和A280进行分析来确定。根据样品的来源情况（表9-2)，高分子量的基因组DNA通常的产量为5~20ul,且A260/A280的值为1.7士0.08。图9-4给出了用Biomek2000自动机械工作平台处理的单个小
鼠尾样品的产董和质量。同时，对纯化的基因组DNA在PCR扩增中的模板效用也进行了评估。从小鼠尾和组织培养样品中纯化的基因组 DNA 中取 1ul 来进行 PCR 扩增，其中小鼠尾样品是用白介素-1(3(IL-lβ) 特异引物的扩增来评估的，而从 HeLa 细胞中分离的基因组DNA 是用 FactorVDNA 特异引物的扩增来评估的（图 9-5)。