检测营养不良基因缺失的诊断性多重 PCR 实验
材料与仪器反应混合物A、B 和 CTaq DNA 聚合酶 DNA 模板 石蜡油 溴化乙锭的微型琼脂糖胶 电泳缓冲液 10 X 胶用载样缓冲液微量吸管 热循环仪
材料与仪器
反应混合物A、B 和 C
Taq DNA 聚合酶 DNA 模板 石蜡油 溴化乙锭的微型琼脂糖胶 电泳缓冲液 10 X 胶用载样缓冲液
微量吸管 热循环仪 微量吸管
Taq DNA 聚合酶 DNA 模板 石蜡油 溴化乙锭的微型琼脂糖胶 电泳缓冲液 10 X 胶用载样缓冲液
微量吸管 热循环仪 微量吸管
步骤
![备用方案为检测出剂量差别而使用的放射性标记低循环数多 重 PCR 接下来的方案通过放射性标记解决了与男性带有重复的营养不良基因和女性缺失型 携带者相关的问题。 附加材料 10mCi/ml [cr32P] dCTP (3000mCi/mmol) 低于2 % 的琼脂糖胶： pourhot (80°C )，必要时预热模式 Centricon 100 浓 缩 器 （ Amicon) 带有固定角度转子（23°〜45°)的离心机：如 Bechman JA-18.1 Whatman 3MM 滤纸 光密度计或PhosphorImager 1. 精确地设计一个PCR反 应 体 系 （ 基本方案，第 1〜5 步） ，另外在第2 步的每管反应 体系中加5 ^ 1 [cr32P] dCTP (lOmCi/mlO.50)。在循环仪上扩增18个 循 环 （ 基本 方案，第 6 步） 。 2.供选择：根据操作守则在一个Centricon 100浓缩器的桶中收集2m l 水，从石蜡油下 面取出液态的P C R 产物，并稀释至水中。以 IOOOg•的转速在一个固定角度转子上离 心 30min，去掉未结合的核苷酸。加 入 2m l 水重新悬浮样品，再次离心。倒置浓缩 器，将浓缩的物质离人retentate cup中。 3. 分离出1/4纯化的PCR产 物 （ 常 规为lOjul，根据装Centricon管子的转子的角度而 定） ，置于中或大号琼脂糖胶上，胶的浓度要一致且小于2 % 。 4•用水简单地清洗一下，将胶表面的放射性物质洗掉。用几片Whatman 3M M 滤纸将 水滴吸干。 5. 将胶放在预热胶干燥器上的一张Whatman 3 M M 滤纸上，并用一张塑料膜盖 住 。 80°C ，将胶干燥30min〜lh。 6. 放射自显影照片2〜24h 。通过在不同的曝光时间照相，确保有一张照片在线性范围 内，用光密度计分析相关的条带的强度，与正常对照进行比较。另外，也可以使用 PhosphorImager 0 支 持 方 案 诊 断 用 PCR混合物的制备和保存 如果引物的质量好，一般不需要特殊的纯化；然而，为了确保扩增的最大效率和产 量，用聚丙烯酰胺胶（ C P M B 单 元 2. 1 2 ) 纯化值得推荐。因为各种引物在一起会增加 盐类物质的污染，如果引物纯化涉及最后的乙醇沉淀步骤，要特别注意尽可能地洗掉盐 类物质。检测男性重复和女性杂合缺失是特别敏感的，为求准确可能要求纯化引物。 材 料 （ 标V 条目参见附录1) 寡核苷酸P C R 引 物 （ 表 9.1.1、表 9.1. 2、表 9.1. 3 和表9.1. 4) 无菌双蒸水](/uploads/allimg/20240525/1-240525154626316.jpg)
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