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PCR技术

PCR-SSCP 技术实验

2024-01-14 PCR技术 加入收藏
PCR-SSCP 技术实验

原理

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

材料与仪器

样本DNA
Taq DNA聚合酶 PCR反应缓冲液 引物 dNTPs 丙烯酰胺 TBE缓冲液 过硫酸铵 TEMED 甲酰胺上样缓冲液 固定液 银染液 显色液
电泳仪 水浴锅 电泳槽

步骤

一、PCR反应

20 ml反应体系成分如下:

模板DNA(100 ng/ml) 1 ml

10×PCR反应缓冲液 2 ml

Taq DNA聚合酶(5 U/ml) 0.2 ml

4×dNTPs(2.5 mmol/L) 1 ml

MTHFR上下游引物 各 1 ml

ddH2O 加至终体积 20 ml


PCR反应循环参数:

95℃ 5 min;

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s,共30个循环;

72℃ 7 min。

反应结束后,置4℃保存。


二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1. 制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶:30%聚丙烯酰胺(交联度49:1)10 ml,5×TBE缓冲液10 ml,加蒸馏水至50 ml,加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入电泳缓冲液(1×TBE),缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

2. 取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀,98℃变性10 min,迅速冰浴。

3. 取5 ml混合液加到点样孔中,以1——8 V/cm电泳4——5 h。


三、聚丙烯酰胺凝胶染色

1. 拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1——2遍。

2. 倒入固定液,固定8——10 min。

3. 用蒸馏水冲洗1——2遍;倒入银染液,银染10——12 min。

4. 用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。

5. 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。


四、结果判断

观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带,根据异常泳动变位筛查突变样本。


注意事项

1. 靶DNA序列长度不宜过长,否则灵敏度下降。

2. DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16——18 cm以上。

3. 染色最好在塑料盘中进行。

4. 环境温度越高,聚丙烯酰胺凝胶越易凝固。应根据环境温度的变化调整

凝胶中10%过硫酸铵与TEMED的用量。

5. 电泳过程中应保持恒温,最好使用薄的凝胶和冷却系统以散发热量。

6. 用AgNO3染色时,染色时间需随环境温度变化作适当调整,环境温度越低,所需的染色时间越长。

7. 显色时间不可过长,以免背景过深影响结果观察。

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