4 类细胞增殖检测实验一文学会

• 细胞增殖检测的应用相当广泛，不论是测试药物试剂还是生长因子的效果，不论是评估细胞毒性还是分析细胞活性状态，可能会用到它。细胞增殖检测一般是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化，主要分为四类：DNA 合成检测、代谢活性检测、细胞增殖相关抗原检测和 ATP 浓度检测。本文手把手教你选择四大方法，匹配细胞类型和研究方案。

   

一、DNA 合成检测

DNA 合成检测是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。传统方法是，将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育几小时或者孵育过夜。这样新增殖细胞的 DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器SC检测。

该方法时间耗时长而且还有个明显的弊端，那就是使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，您还可以使用 5-溴-2-脱氧尿苷 BrdU 来进行类似实验，因为 BrdU 也同样可以掺入到新合成的 DNA 中。

不过这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性 BrdU 单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的好处就是让您不需要再和放射性物质打交道。BrdU 标记很适合免疫组化 IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内 ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。

二、代谢活性检测

检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，因此四唑盐或者 Alamar Blue 在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。您可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪 来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS 和 WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在 DMSO 或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与 Alamar Blue 一样，都是可溶且无毒的。

它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中 XTT 的效率较低，需要添加额外的因子。而 WST1 更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色。Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有 100 个细胞它就能够检测到。

四唑盐和 Alamar Blue 氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。

三、增殖标志检测

有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67 抗体识别同名蛋白，在细胞周期 S 期、G2 期和 M 期表达，而在 G0 期和 G1 期(非增殖期)不表达。

用针对 Ki-67 蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原 PCNA、拓扑异构酶 IIB 和磷酸化组蛋白 H3。

四、ATP 检测

细胞内的 ATP 含量受到了严格调控，检测 ATP 也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含 ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的 ATP 浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。

利用荧光素酶 luciferase 及其底物荧光素 luciferin 的 ATP 检测以生物发光为基础，能够为您提供非常灵敏的结果。如果有 ATP 存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与 ATP 浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。

适合才是最好的

怎样选择最适合自己的检测方法，这依赖于您的细胞类型和研究方案，当然还取决于您在细胞增殖中期望得到的信息。举例来讲，假如您已经有了待测细胞(不论是在培养板还是在溶液中)，希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，那您可以使用四唑盐和比色法检测。

相应的，如果您对 DNA 合成的改变更感兴趣，可以选择用 BrdU 标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。

若您研究的是单个细胞，也可以用 BrdU 标记来检测 DNA 合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，您就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。本文介绍的四种方案都是久经考验的可靠方法，选择最适合自己的检测方式，好结果自然水到渠成。