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PCR技术

从琼脂糖凝胶中纯化 PCR 片段实验

2024-05-17 PCR技术 加入收藏
材料与仪器乙醇 溴化乙锭 电泳缓冲液 PCR 片段 琼脂糖凝胶 细胞和组织微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置步骤一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂(1)乙酵(9

材料与仪器

乙醇 溴化乙锭 电泳缓冲液 PCR 片段 琼脂糖凝胶 细胞和组织
微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

(1)乙酵(95%)

(2)嵌入染料,如溴化乙锭

(3)TAE 电泳缓冲液

         40 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐,pH8.2

         1mmol/LEDTA

或(4)TBE 电泳缓冲液

         90 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐,pH8.3

         2 mmol/LEDTA

2. 核酸和寡核苷酸

来自琼脂糖凝胶中的 PCR 片段

3. 胶

琼脂糖凝胶(常规或低熔点)

4. 特殊设备

微量离心管,1.5 ml

解剖刀或剃须刀片

长波长紫外灯

真空装置和真空适配器(Promega; 用于真空纯化)

5. 其他

WizardSV 胶和 PCR 纯化系统(Promege; 包括 SV 微型柱、收集管、膜结合溶液、膜洗涤溶液和无核酸酶的水)

6. 细胞和组织

用于纯化的 PCR 样品

二、方法

应穿戴标准安全服,尤其是处理由溴化乙锭染过的琼脂糖凝胶时,要戴手套和一个用于保护眼和脸免受紫外线伤害的紫外屏蔽面罩。

1. 凝胶的溶解

(1)将 PCR 样品上到琼脂糖凝胶的泳道内,根据已有方法进行电泳。

(2)用于存放凝胶的 1.5 ml 微量离心管要逬行称量并记录重量。

(3)利用长波长紫外灯和染料如溴化乙锭使 DNA 成像并拍照。为减少 DNA 形成缺口,尽量缩短对凝肢的照射时间(GrundemannandSchomig1996;Zimmermanneta!.1998)。使用干净的解剖刀或剃须刀片将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下,凝肢的体积要尽可能小。将凝胶转移到已称重的微量离心管中,称重并记录质量后,从总质量中减去空管的质量以得到凝胶块的质量。

(4)按照每 10 mg 琼脂糖凝胶需 10ul 溶液的比例加入膜结合溶液。

(5)振荡混合物并于 50~65°C:下温育 l0min 直到凝胶彻底溶解,每数分钟便振荡试管次以提高琼脂糖凝胶熔化的速度,室温下短时间离心试管以确保内容物位于试管底部。琼脂糖凝胶一旦熔化,便不会在室温下重新凝固。

(6) 用离心或真空过滤法可将 DNA 纯化。

2. 离心法纯化 DNA

(1) 在每一目的片段对应的收集管中放置一个 SV 微型柱。

(2) 将已溶解的凝胶混合物转移到 SV 微型柱中,室温下保温 lmin。

(3)1000g 离心1min,取出微型柱后,弃收集管内液体,将微型柱放回到收集管。

(4) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液,10000 g 离心 lmin 来洗涤微型柱。用前述方法倒空收集管,将微型柱放回收集管,用 500ul 膜洗涤液重复洗柱,l0000g 离心 5 min。

(5) 小心取出微型柱避免滤过物弄湿柱的底部,若柱已变湿,倒空收集管后重新离心 1min。

(6) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微量离心管中,直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水,勿将移液管吸头触到膜上。室温下保温1min 后,10000 g 离心1min。

(7) 弃微型柱,于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。

3. 真空法纯化 DNA

(1) 向对应于每个含有目的片段的凝胶或 PCR 样的真空装置的端口系一个带有 Luer-Lok装置的真空适配器,然后在每个真空适配器中插入一个 SV 微型柱使其紧贴于其空适配器。

(2) 将溶解的凝肢混合物或 PCR 扩增反应混合物转移到微型柱中,室温下温育 1min, 通过抽真空来推动液体完全通过微型柱。

(3) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液以洗涤微型柱,要确保所有来自上一步的留在微型柱壁上的小液滴被彻底洗去,通过抽真空推动液体完全通过微型柱后,用 500ul 膜洗涤液进行第二次洗涤。

(4) 停止抽真空,打开一个未使用端口以取出真空装置。从真空装置中取出微型柱,将其转移到一个收集管中,l0000 g 离心 5 min 以去除所有残留的旗洗涤液。

(5) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微董离心管中,直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水,勿接触到膜。室溫下保温 1 min,10000 g 离心 1min。

(6) 弃微型柱,于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。



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