从琼脂糖凝胶中纯化 PCR 片段实验
材料与仪器乙醇 溴化乙锭 电泳缓冲液 PCR 片段 琼脂糖凝胶 细胞和组织微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置步骤一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂（1）乙酵（9
材料与仪器
乙醇 溴化乙锭 电泳缓冲液 PCR 片段 琼脂糖凝胶 细胞和组织
微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置
微量离心管 解剖刀 紫外灯 真空装置
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
（1）乙酵（95%)
（2）嵌入染料，如溴化乙锭
（3）TAE 电泳缓冲液
40 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐,pH8.2
1mmol/LEDTA
或（4）TBE 电泳缓冲液
90 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐,pH8.3
2 mmol/LEDTA
2. 核酸和寡核苷酸
来自琼脂糖凝胶中的 PCR 片段
3. 胶
琼脂糖凝胶（常规或低熔点）
4. 特殊设备
微量离心管，1.5 ml
解剖刀或剃须刀片
长波长紫外灯
真空装置和真空适配器（Promega; 用于真空纯化）
5. 其他
WizardSV 胶和 PCR 纯化系统（Promege; 包括 SV 微型柱、收集管、膜结合溶液、膜洗涤溶液和无核酸酶的水）
6. 细胞和组织
用于纯化的 PCR 样品
二、方法
应穿戴标准安全服，尤其是处理由溴化乙锭染过的琼脂糖凝胶时，要戴手套和一个用于保护眼和脸免受紫外线伤害的紫外屏蔽面罩。
1. 凝胶的溶解
（1）将 PCR 样品上到琼脂糖凝胶的泳道内，根据已有方法进行电泳。
（2）用于存放凝胶的 1.5 ml 微量离心管要逬行称量并记录重量。
（3）利用长波长紫外灯和染料如溴化乙锭使 DNA 成像并拍照。为减少 DNA 形成缺口，尽量缩短对凝肢的照射时间（GrundemannandSchomig1996;Zimmermanneta!.1998)。使用干净的解剖刀或剃须刀片将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，凝肢的体积要尽可能小。将凝胶转移到已称重的微量离心管中，称重并记录质量后，从总质量中减去空管的质量以得到凝胶块的质量。
（4）按照每 10 mg 琼脂糖凝胶需 10ul 溶液的比例加入膜结合溶液。
（5）振荡混合物并于 50~65°C：下温育 l0min 直到凝胶彻底溶解，每数分钟便振荡试管次以提高琼脂糖凝胶熔化的速度，室温下短时间离心试管以确保内容物位于试管底部。琼脂糖凝胶一旦熔化，便不会在室温下重新凝固。
(6) 用离心或真空过滤法可将 DNA 纯化。
2. 离心法纯化 DNA
(1) 在每一目的片段对应的收集管中放置一个 SV 微型柱。
(2) 将已溶解的凝胶混合物转移到 SV 微型柱中，室温下保温 lmin。
(3)1000g 离心1min，取出微型柱后，弃收集管内液体，将微型柱放回到收集管。
(4) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液，10000 g 离心 lmin 来洗涤微型柱。用前述方法倒空收集管，将微型柱放回收集管，用 500ul 膜洗涤液重复洗柱，l0000g 离心 5 min。
(5) 小心取出微型柱避免滤过物弄湿柱的底部，若柱已变湿，倒空收集管后重新离心 1min。
(6) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微量离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿将移液管吸头触到膜上。室温下保温1min 后，10000 g 离心1min。
(7) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。
3. 真空法纯化 DNA
(1) 向对应于每个含有目的片段的凝胶或 PCR 样的真空装置的端口系一个带有 Luer-Lok装置的真空适配器，然后在每个真空适配器中插入一个 SV 微型柱使其紧贴于其空适配器。
(2) 将溶解的凝肢混合物或 PCR 扩增反应混合物转移到微型柱中，室温下温育 1min, 通过抽真空来推动液体完全通过微型柱。
(3) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液以洗涤微型柱，要确保所有来自上一步的留在微型柱壁上的小液滴被彻底洗去，通过抽真空推动液体完全通过微型柱后，用 500ul 膜洗涤液进行第二次洗涤。
(4) 停止抽真空，打开一个未使用端口以取出真空装置。从真空装置中取出微型柱，将其转移到一个收集管中，l0000 g 离心 5 min 以去除所有残留的旗洗涤液。
(5) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微董离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿接触到膜。室溫下保温 1 min,10000 g 离心 1min。
(6) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。
1. 缓冲液、溶液和试剂
（1）乙酵（95%)
（2）嵌入染料，如溴化乙锭
（3）TAE 电泳缓冲液
40 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐,pH8.2
1mmol/LEDTA
或（4）TBE 电泳缓冲液
90 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐,pH8.3
2 mmol/LEDTA
2. 核酸和寡核苷酸
来自琼脂糖凝胶中的 PCR 片段
3. 胶
琼脂糖凝胶（常规或低熔点）
4. 特殊设备
微量离心管，1.5 ml
解剖刀或剃须刀片
长波长紫外灯
真空装置和真空适配器（Promega; 用于真空纯化）
5. 其他
WizardSV 胶和 PCR 纯化系统（Promege; 包括 SV 微型柱、收集管、膜结合溶液、膜洗涤溶液和无核酸酶的水）
6. 细胞和组织
用于纯化的 PCR 样品
二、方法
应穿戴标准安全服，尤其是处理由溴化乙锭染过的琼脂糖凝胶时，要戴手套和一个用于保护眼和脸免受紫外线伤害的紫外屏蔽面罩。
1. 凝胶的溶解
（1）将 PCR 样品上到琼脂糖凝胶的泳道内，根据已有方法进行电泳。
（2）用于存放凝胶的 1.5 ml 微量离心管要逬行称量并记录重量。
（3）利用长波长紫外灯和染料如溴化乙锭使 DNA 成像并拍照。为减少 DNA 形成缺口，尽量缩短对凝肢的照射时间（GrundemannandSchomig1996;Zimmermanneta!.1998)。使用干净的解剖刀或剃须刀片将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，凝肢的体积要尽可能小。将凝胶转移到已称重的微量离心管中，称重并记录质量后，从总质量中减去空管的质量以得到凝胶块的质量。
（4）按照每 10 mg 琼脂糖凝胶需 10ul 溶液的比例加入膜结合溶液。
（5）振荡混合物并于 50~65°C：下温育 l0min 直到凝胶彻底溶解，每数分钟便振荡试管次以提高琼脂糖凝胶熔化的速度，室温下短时间离心试管以确保内容物位于试管底部。琼脂糖凝胶一旦熔化，便不会在室温下重新凝固。
(6) 用离心或真空过滤法可将 DNA 纯化。
2. 离心法纯化 DNA
(1) 在每一目的片段对应的收集管中放置一个 SV 微型柱。
(2) 将已溶解的凝胶混合物转移到 SV 微型柱中，室温下保温 lmin。
(3)1000g 离心1min，取出微型柱后，弃收集管内液体，将微型柱放回到收集管。
(4) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液，10000 g 离心 lmin 来洗涤微型柱。用前述方法倒空收集管，将微型柱放回收集管，用 500ul 膜洗涤液重复洗柱，l0000g 离心 5 min。
(5) 小心取出微型柱避免滤过物弄湿柱的底部，若柱已变湿，倒空收集管后重新离心 1min。
(6) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微量离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿将移液管吸头触到膜上。室温下保温1min 后，10000 g 离心1min。
(7) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。
3. 真空法纯化 DNA
(1) 向对应于每个含有目的片段的凝胶或 PCR 样的真空装置的端口系一个带有 Luer-Lok装置的真空适配器，然后在每个真空适配器中插入一个 SV 微型柱使其紧贴于其空适配器。
(2) 将溶解的凝肢混合物或 PCR 扩增反应混合物转移到微型柱中，室温下温育 1min, 通过抽真空来推动液体完全通过微型柱。
(3) 向微型柱中加入 700ul 膜洗涤液以洗涤微型柱，要确保所有来自上一步的留在微型柱壁上的小液滴被彻底洗去，通过抽真空推动液体完全通过微型柱后，用 500ul 膜洗涤液进行第二次洗涤。
(4) 停止抽真空，打开一个未使用端口以取出真空装置。从真空装置中取出微型柱，将其转移到一个收集管中，l0000 g 离心 5 min 以去除所有残留的旗洗涤液。
(5) 将微型柱转移到一个干净的 1.5 ml 微董离心管中，直接向柱的中央加 50ul 无核酸酶的水，勿接触到膜。室溫下保温 1 min,10000 g 离心 1min。
(6) 弃微型柱，于 4°C 或-20°C 保存洗脱 DNA。
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