分子克隆实操技术

目的 DNA 或者 cDNA

引物（带有酶切位点和保护碱基等）

PCR 试剂、载体质粒、限制性内切酶

琼脂糖、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒

T4 DNA 连接酶、大肠杆菌

LB 平板和 LB 肉汤培养基

氨苄或者卡那抗生素、质粒抽提试剂盒

1、首先合成引物对目的基因进行 PCR 扩增，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的 DNA 片段。

2、将目的 DNA 片段和载体质粒进行酶切，回收后进行连接，建议 4 ℃ 连接过夜。

3、转化感受态细胞。取出感受态细胞置于冰上融化，加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min，42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min。

在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL，轻轻混匀放置于 37 ℃ 摇床中 200 rpm 震荡培养 1 h 后，5000 rpm 离心 5 min 收菌，留约 100 μL 上清轻轻吹打混匀，均匀涂布接种于含抗生素的固体 LB 平板中，倒置于 37 ℃ 培养箱中培养 12~16 h 左右。

4、筛选阳性克隆。挑取单个菌落于 1.5 mL EP 管中，振荡培养 1~2 h 后取 1 μL作为模板，进行菌液 PCR 验证，观察是否出现目的条带。

5、试管扩大培养。将上述验证正确的菌液，加入 5~20 mL 含抗生素的 LB 肉汤培养基，37 ℃ 摇床培养过夜（12~16 h），按照质粒抽提试剂盒进行提取，可以再次酶切或者测序验证。