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DNA实验

m6A 甲基化修饰水平测定

2024-05-17 DNA实验 加入收藏
原理原理类似于 Elisa 检测,将目标 RNA 与 包被 m6A 抗体的板孵育,然后洗脱,只有和板中 m6A 抗体结合才能保留下来,进行抗体信号生成反应,最后

原理

原理类似于 Elisa 检测,将目标 RNA 与 包被 m6A 抗体的板孵育,然后洗脱,只有和板中 m6A 抗体结合才能保留下来,进行抗体信号生成反应,最后检测抗体信号。

用途

甲基化修饰。

材料与仪器

RNA 提取所需试剂,24 孔板,EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit(Colorimetric,P-9005-96)

步骤

使用 EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit 测定 m6A 甲基化修饰水平的步骤如下:

1、样品准备:利用 Trizol 法从组织或细胞中提取 Total RNA,24 孔板每孔 200 ng;

2、试剂配制:将 WB(Wash Buffer)、CA(Capture Antibody)、DA(Detection Antibody)、ES(Enhancer Solution)进行稀释;

3、RNA 结合:取出所需 strip 条,剩下的包裹好放入 4 ℃,每孔加入 80 μL BS(Binding Solution)然后依次加入 1 μL NC(Negative Control),1 μL PC(Positive Control),1 μL SP(Sample),轻轻摇晃混匀,用保鲜膜封住孔,37 ℃ 孵育 90 min;

4、除去每孔中的 BS,加入 150 μL 稀释的 Wash Buffer,然后用枪吸走,共洗三遍;

5、m6A 捕获

a.每孔加 50 μL 稀释的 CA,室温孵育 60 min;

b.吸去孔中的 CA,加 150 μL WB,用枪吸走,一共洗 3 遍;

c.每孔加 50 μL DA,室温孵育 30 min;

d.吸去孔中的 DA,加 150 μL WB,用枪吸走,一共洗 4 遍;

e.每孔加 50 μL ES,室温孵育 30 min;

f.吸去孔中的 ES,加 150 μL WB,用枪吸走,一共洗 5 遍;

6、信号检测

a.每孔加 100 μL DS,避光室温孵育 1 h 10 min;

b.每孔加 100 μL SS,颜色变黄,2 min 15 s 内在 450 nm 处测定吸光度。

注意事项

加样、洗脱要精确,避免孔与孔之间的差异。

常见问题

复孔差异较大。



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