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DNA实验

甲基化 RNA 免疫共沉淀

2024-05-17 DNA实验 加入收藏
原理甲基化 RNA 免疫共沉淀基于甲基化抗体特异性结合甲基化修饰的碱基,以磁珠包被的抗体结合修饰的 RNA,通过免疫结合,纯化富含甲基化修饰的 RNA。用途mR

原理

甲基化 RNA 免疫共沉淀基于甲基化抗体特异性结合甲基化修饰的碱基,以磁珠包被的抗体结合修饰的 RNA,通过免疫结合,纯化富含甲基化修饰的 RNA。

用途

mRNA 修饰,转录和翻译水平的调控。

材料与仪器

无菌 1×PBS,检测试剂盒(Magna RIPTMKit, 12Reactions,  Millipore-MAGNARIP01)
,细胞,细胞计数器,RNase-free 管,Anti m6A 抗体 (EMD, MABE1006),氯仿,无水乙醇。

步骤

使用 Magna RIPTMKit 进行 MeRIP 实验的操作步骤如下:

1、用预冷的无菌 1×PBS 清洗细胞,然后用胰酶消化后于 1 500 rpm 离心 5 min,收集细胞,再用 1×PBS 重悬清洗细胞并转移至 RNase-free 管中,对细胞进行计数(总 RNA 量约 300 μg,细胞数不少于 1×108)。

2、再次离心收集细胞沉淀,根据沉淀的体积,加入等量的 RIP Lysis Buffer,每 100 μL 的 RIP Lysis Buffer 加 0.5 μL Protease Inhibitor cocktail 和 0.25 μL RNase Inhibitor,将样品混匀,冰上放置 10 min,于 -80 ℃ 过夜以充分裂解细胞。

3、次日,于冰上使裂解液融化,并于 4 ℃、12 000 rpm 离心 10 min,转移上清至新的 1.5 mL RNase-free 管中。

4、Anti m6A 抗体与磁珠 Protein A/G 相结合

a.枪头轻轻吹打 ProteinA/G 磁珠使其悬浮分散,吸取 50 μL 体积的磁珠于 RNase free 管中,加入 500 μL 的 RIP Wash Buffer 混匀磁珠置于磁柱上,待磁珠吸附于管壁,弃上清,按此步骤清洗磁珠两次;

b.加入 100 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠,并分别加入约 5 μg m6A 抗体和鼠 IgG 抗体,置于 DNA 混合仪上 10 转/分钟常温孵育 30 min;

c.将上述磁珠置于磁柱上,弃上清,吸取 500 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠,置于磁柱上,待磁珠吸附于管壁,弃上清,按此步骤清洗磁珠两次;

5、Anti m6A 抗体与包含 m6A 位点的 circRNA/mRNA 相结合

a.加入 860 μL RIP Wash Buffer、35 μL 0.5 M EDTA 和 5 μL RNA 酶抑制剂混匀,重悬步骤 4 中的磁珠,吸取 100 μL 步骤 3 中的细胞裂解液上清至磁珠抗体复合物中,使免疫沉淀反应的终体积为 1 mL 并留存 10 μL 细胞裂解液于 RNase free 管作为 10% Input,存于 -80 ℃;

b.将上述 RIP 反应体系于 DNA 混合仪上 10 转/分钟 4 ℃ 孵育过夜;

c.将 RIP 反应液置于磁柱上,弃上清,加入 500 μL RIP Wash Buffer 重新悬浮磁珠,置于磁柱上,待磁珠吸附于管壁,弃上清,按此步骤清洗磁珠五次,最后使用预冷的 500 μL RIP Wash Buffer 重悬磁珠;

6、洗脱包含 m6A 位点的 circRNA/mRNA

a.将上一步的磁珠置于磁柱上,倒掉上清,加入 117 μL RIP Wash Buffer、15 μL 10% SDS 和 18 μL Proteinase K 混匀重悬磁珠;

b.将存于 -80 ℃ 的 Input 拿出融解,加入 107 μL RIP Wash Buffer、15 μL 10% SDS 和 18 μL Proteinase K,使终体积为 150 μL;

c.将上述所有 RNase-free 管置于 55 ℃ 振荡孵育 30 min,以消化蛋白质;

d.将 RNase-free 管置于磁柱上转移上清于新的 RNase-free 管中,并每管加入 250 μL RIP Wash Buffer;

7、纯化提取免疫沉淀 RNA

a.在上述液体中加入 400 μL 异戊醇:三氯甲烷:苯酚(体积比为 1:24:125),涡旋混匀 15 s 左右,然后 12 000 rpm,室温离心 10 min 以分离各相;

b.吸取上层液体加入 400 μL 三氯甲烷,涡旋 15 s 左右,12 000 rpm 室温离心 10 min;

c.取水相,每管加入 50 μL Salt Solution I、15 μL Salt SolutionII、5 μL Precipitate Enhancer,并加入 850 μL 无水乙醇混匀,于 -80 ℃ 过夜以达到沉淀 RNA 的目的;

d.解冻后于 4 ℃,12 000 rpm 离心 30 min,小心弃上清,80% 乙醇洗涤沉淀一次,然后于 4 ℃,12 000 rpm 离心 15 min,小心弃上清并晾干沉淀,加入 10~20 μL RNase-free Water;

8、将提取的 RNA 使用 NanoDrop 测浓度后进行反转录,后续进行 qRT-PCR。

注意事项

细胞量要足够,否则RNA量太少;清洗磁珠次数不能过多或过少。

常见问题

提取 RNA 浓度太低。


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