染色体显微切割

一、显微切割中期染色体的制备

1.取 0.5 mL 外周血与含 PHA 的 4.5 mL RPMI1640 培养液混合，在 37°C 培养细胞 64~68 h。

2.收获细胞前 20 min 在培养基中加入 25 ml 秋水仙胺（lO^g/mL)，继续在 37°C 培养。

3.将细胞培养物移至 15 mL 离心管中 250 g 离心 5 min，然后小心弃上清。

4.用 10 mL 低渗液重悬细胞沉淀，37°C 水浴中温育 12~18 min，250 尽离心 5 min，弃上清。

5.用 8 mL 新鲜配制的 Camoy 固定液轻柔地重悬细胞，将试管放置冰中至少 2 h，250 g 离心 5 min，然后小心弃上清。

6.用 5 mL 固定液洗细胞 2 次，250 g 离心 5 min。

7.用 0.5~1.5 mL 固定液重悬细胞，获得有点不透明的悬液用于滴片（见注释 2)。

8.滴 2 或 3 滴细胞悬液在干净的呈 45°角倾斜的盖玻片上，随液体的流动铺匀整张片子，不要吹片子避免污染。

9.将片子在 37°C 无菌容器中可放置 3~5d 备用（见注释 3)。

10.在显微切割前完成用胰蛋白酶-Giemsa 处理的标准 G 带。用胰蛋白酶工作液在室温中处理 1~2 min/将片子移至室温条件下的 Giemsa 工作液 5 min，然后用蒸馏水漂洗片子，气干。

二、显微切割和拓扑异构酶 I 处理

1.在倒置显微镜下找到靶染色体，该显微镜有可随意转动的载物台，以使靶染色体垂直于玻璃针的移动轴。如果可能，显微镜应放在防震的台面上以减少振动。

2.用固定在显微镜上的显微操作装置控制的玻璃针切割靶染色体区域（见注释 4)。

3.将玻璃针的针尖放置在靶 DNA 片段的正上方，然后向下移动玻璃针轻轻触及该片段。利用静电的力量将 DNA 片段吸到针尖，然后移动针尖到 5ul 收集液中。

4.在收集到预期数量（5 拷贝）的切割 DNA 片段后，滴一滴矿物油覆盖在收集液上。在显微切割的 DNA 扩增前，用拓扑异构酶 I37°C 处理 Ih 使结构非常紧密的 DNA 解旋。

三、扩增切割的 DNA

1.进行 PCR 启动程序（5~8 个循环，94°C、lmin，30°C、2 min，37°C、2 min)，在每个循环的 30℃ 时加入约 0.3U 的测序酶（13U/mL 的测序酶用酶稀释缓冲液稀释 1~8 倍，在 5uL 的反应体系中加入 0.2PL 测序酶稀释液)。

2.完成上述预扩增步骤后，在同一 PCR 管中进行 Taq 酶参与的常规 PCR 反应，PCR 体系为 5uL，PCR 反应条件：94°C、lmin，56°C、lmin，72°C、I.5 min 的 30 循环，最后在 72°C 延伸 5 min。

3.加 2uL 第一轮 PCR 产物到另一个 50ul PCR 反应体系中，进行 20 个 PCR 循环，反应条件同步骤 2。

4.可用电泳分析识别处理的是否成功，将 5ul PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳。PCR 产物的大小范围应在 200~800bp。

四、荧光原位杂交

1.制备 FISH 探针，加第二轮的 PCR 产物到与上述步骤相同的 50 斗 PCR 反应体系（除了加入终浓度为 20umol/L 生物素-16-dUTP 外）中，继续 PCR 反应 20 个循环:.94°C、lmin，56°C、1min，72°C、2 min，最后在 72°C 延伸 5 min。

2.按照产品说明的步骤用 Bio-gelP6 过滤柱上离心 PCR 产物，以去除未掺入 生物素-16-dUTP。

3.用 1/10 体积 3mol/L 乙酸钠和 2 倍体积乙醇在 4°C 沉淀探针 20 min。4°C 条件下用 10000 g 离心 15 min，用 4 〇!uLTE 缓冲液重悬探针。

4.FISH 探针杂交是基于以前介绍的操作步骤基础上 [12]。简言之，对于每个杂交反应，大约 IOOng 标记的探针混合于 IOpL 杂交缓冲液（7pL 杂交混合液、2 斗探针和 lyL 人 Cotl-DNA) 中，在 75°C 变性 5 min，接着在 37°C 预杂交 20 min。

5.中期染色体标本需在 72°C 变性液中变性 2 min，然后将标本用 70%、85% 和 100% 的乙醇系列脱水。

6.将含有探针的杂交缓冲液滴在变性后的片子上，盖上 22 mmX22 mm 盖玻片，用橡皮胶封片。移至 37°C 湿盒中杂交过夜。

7.杂交完成后，移去盖玻片，将片子用 45°C 洗液 I 洗 3 次，每次 5~1Omin。

8.室温下用洗涤液 II 洗 3 次，用洗涤液 III 洗 1 次，每次 2 min。

9.只含有直接标记探针的杂交可在此时进行分析。用生物素标记探针的杂交，用 40 ML 含 5；xg/mLFITC-亲和素的 PNM 缓冲液室温处理 20 min。然后按步骤 8 洗涤标本。

10.染色体标本经 40 斗含 5ug/mL 抗亲和素抗体的 PNM 缓冲液室温处理 20 min，将荧光信号放大；然后按步骤 8 洗涤标本。

11.染色体标本通常用另一层的 FTTC-亲和素处理，处理条件同步骤 9。

12.染色体标本经过 70%、85% 和 100% 乙醇系列脱水，空气中干燥。用 40juL 含 DAPI(ljug/mL) 的抗淬灭剂液复染，盖上盖玻片，用装有合适滤光片的荧光显微镜进行观察。

1.为了减少污染带来的影响，所有装试剂的玻璃器皿都要清洗并在用前髙压灭菌2次。高纯度的水用0.22um 滤器过滤后再用高压灭菌2次，40 min。同样，盐溶液也需要用高纯度的试剂来配制，按照水过滤和高压灭菌的方式进行准备。

2.用Camoy固定液固定细胞（甲醇：冰乙酸=3:1); 用固定液保存1年内的细胞可获得高质量的FISH探针。

3.用于显微切割的中期染色体标本片龄最好为3?14d; 标本暴露于高温环境（>60°C) 或存放时间过长可降低切割产物的质量。

4.玻璃针是用一个自动化的、弹簧负载的移液管成型器制备。针尖断点的直径与染色体的宽度一致，针要放在无菌的培养皿中保存，每次使用前要用紫外灯照射 5 min，确保消除 DNA 污染。

5.DNA 污染是扩增切割的 DNA 的关键问题，由于最初切割的 DNA 量非常小（1(T13?KT14 g/片段），即使很小量的 DNA 污染也可淹没切割的 DNA 而产生无用的 PCR 扩增产物。污染的 DNA 可由玻璃针接触其他 DNA 而来，也可当反复开关试管盖时来自空气中，甚至来自切割前试剂中外源 DNA 的污染。因此，所有用于显微切割的试剂在使用前都应检测有无污染。检测用 o.Ing 人类全基因组 DNA 或无 DNA 进行普通 PCR 反应，经过 40 个循环：94°C、lmin，56°C、lmin，72°C、2 min，进行 PCR 的试剂纯度可用电泳分析来检验。当阳性对照产物为 200?800bp 时，阴性对照产物很少或无可见产物，这些试剂对于显微切割是适合的；否则对体系中每一个试剂都进行替换直到得到阴性空白。当所有 PCR 反应试剂都证实是适合显微切割后，还应检测拓扑异构酶和测序酶。