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DNA实验

λ噬菌体载体DNA的碱性磷酸酶处理实验

2024-05-21 DNA实验 加入收藏
原理λ 噬菌体两臂内部末端 5'-磷酸基团的去除,能有效防止自连和减少非重组噬菌体的背景。当使用含单一克隆位点的插入型载体(如 λgt10、λgt11


原理

λ 噬菌体两臂内部末端 5'-磷酸基团的去除,能有效防止自连和减少非重组噬菌体的背景。当使用含单一克隆位点的插入型载体(如 λgt10、λgt11 和 λORF8)或使用虽含多克隆位点但用单一酶切割的插入型载体(如 λgt18-23 和 λZAP) 时,本方法可被用于抑制非重组子背景。

材料与仪器

噬菌体 T4 DNA 连接酶 牛小肠碱性磷酸酶 去磷酸缓冲液 蛋白酶 K 限制性内切核酸酶 λ 噬菌体 DNA λ 噬菌体包装混合物
λ 复性缓冲液 氯仿 EDTA 乙醇 酚:氯仿 SDS 乙酸钠 TE Tris-Cl
狗脚指甲钳 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

(1) λ 复性缓冲液

100 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)

10 mmol/L MgCl2

(2) ATP ( 10 mmol/L)

(3) 氯仿

(4) EDTA ( 0.5 mmol/L,pH 8.0)

(5) 乙醇

(6) 酚:氯仿(1:1,V/V)

(7) SDS (10%,m/V)

(8) 乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2 和 pH 7.0)

(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

(10) Tris-Cl (10 mmol/L,pH 8.3)

2. 酶和缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

牛小肠碱性磷酸酶

10X 去磷酸缓冲液(100 mrnol/L Tris-Cl (pH8.3),10 mmol/L ZnCl2,10 mmol/L MgCl2

蛋白酶 K

限制性内切核酸酶

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体 DNA

4. 专用设备

狗脚指甲钳(dog toe-nail clipper) 或宽口尖头

预置于 16℃、42℃、56℃、68℃ 的水浴

5. 载体和菌株

λ 噬菌体包装混合物

二、方法

1. 将 50~60 μg 适宜的 λ 噬菌体载体 DNA 溶解于 λ 复性缓冲液中,终体积为 150 μl。42℃ 温育 1 h,使含有 cos 位点的病毒 DNA 末端复性。

2. 加入 20 μl 10X 连接酶缓冲液,20 μl 10 mmol/L ATP(如果必要),以及 0.2~0.5 Weiss 单位的 T4 DNA 连接酶/μg DNA,16℃ 温育 1~2 h。

3. 用酚:氯仿抽提连接反应。

4. 微量离心机中室温离心 1 min 以分离有机相和亲水相,将含病毒 DNA 的亲水相转移至一新离心管中。转移过程用配有一次性尖头的自动移液设备来完成,而这些尖头已用狗脚指甲钳剪断以增加孔径。

5. 经标准的乙醇沉淀回收 DNA,然后沉淀用 1 ml 70% 乙醇进行洗涤并离心 2 min。除去上清--70% 的乙醇,将打开的离心管置于实验台上,使乙醇挥发,然后将 DNA 沉淀重新溶解于 150 μl TE ( pH 8.0) 中。

6. 用一种或多种限制酶消化。

7. 重复步骤 3 和 4。

8. 加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠(pH 7.0)和 2 倍体积的乙醇,4℃ 离心 10 min 以回收 DNA,用 1 ml 70% 乙醇洗涤,再离心 2 min,去掉乙醇,将离心管敞口置于实验台上使残余乙醇挥发。

9. 将上述 DNA 沉淀溶解于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3) 中,终浓度为 100 μg/ml。取一 0.2 μg 的 DNA 组分,置冰浴保存,余下的按下面所述用过量的 CIF 37℃ 作用 1 h:

(1) 加入 0.1 倍体积的 10X 去磷酸缓冲液和每 10 μg λ 噬菌体 DNA 加 0.01 单位 CIP。

(2) 混匀,37℃ 温育 30 min,加另一份 CIP,继续温育 30 min。

10. 加入 SDS 和 EDTA ( pH 8.0) 至终浓度分别为 0.5% 和 5 mmol/L,用轻微涡旋振荡混匀溶液,加蛋白酶 K 至终浓度 100 μg/ml,56℃ 温育 30 min。

11. 冷却至室温,用酚:氯仿和氯仿各抽提一次以纯化 DNA,在 0.3 mol/L 乙酸钠 (pH 7.0) 存在的条件下,用乙醇沉淀以回收 DNA。

12. 将 DNA 溶解于 TE ( pH 7.6),浓度为 300~500 μg/ml,随后将此去磷酸化 DNA 分成多个 1~5 μg 的组分,保存于 -20℃。

13. 通过连接 CIP 处理前后的消化载体组分(0.2 μg) 以测定去磷酸化的效率。将 DNA 包装入噬菌体颗粒,测定感染滴度。

磷酸酶处理将导致噬菌体臂的连接和包装效率降低 2~3 个数量级。


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