长距离PCR

在标准 PCR 反应条件下，PCR 扩增 DNA 片段的长度一般为 1~2 kb，这种扩增能力对许许多多常规的 DNA 分子操作技术要求来说是已经足够了（如 DNA 序列分析和基因突变等)，但是对于扩增某些大的完整的哺乳动物基因组基因，甚至中等大小的基 因组基因以及对于一种平均长度的全长 dDNA，这种 PCR 扩增能力还是远未达到实验要求的。

DNA 模板 正向引物
氯仿 dNTP 贮存液 长距离 PCR 缓冲液 热稳定 DNA 聚合酶混合液
琼脂糖凝胶 屏蔽型枪头 离心管 正向排液式移液器 PCR 仪

一、材料

1. 缓冲液与溶液

氯仿

4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

10X 长距离 PCR 缓冲液（500 mmol/L Tris-Cl ( pH 9.0，室温），160 mmol/L 硫酸铵，25 mmol/L MgCl2，1.5 mg/ml 牛血清白蛋白）

2. 酶与缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶混合液

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核苷酸与寡核苷酸

DNA 模板

正向引物（20 μmol/L) 与反向引物（20 μmol/L）溶于水

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）

正向排液式移液器

PCR 仪

二、方法

1. 用一只薄壁扩增离心管，依次加入如下试剂，混合：

10X 长距离 PCR 扩增缓冲液            5 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液           5 μl

20 mmol/L 正向引物                       1 μl

20 mmol/L 反向引物                       1 μl

热稳定 DNA 聚合酶混合液               0.2 μl

DNA 模板                                      100 pg~2 μg

H2O 补足至                                    50 μl

2. 如果 PCR 仅没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴透明的矿物油（约 50 μl）；若应用热启动 PCR 程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。按以下方法进行 PCR 扩增。典型的程序有变性、复性和聚合 (延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



3. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤 2)，反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

4. 抽取扩增产物水相的若干样品，用琼脂糖凝胶电泳再辅以适当大小的 DNA marker 来分析扩增结果。在许多情况下，扩增产物太少以致于用常规的溴化乙锭染色不能检测到目的条带。在这种情况下，用 SYBR 金颗粒对凝胶上的 DNA 样品进行染色或转移凝胶上的 DNA 样品到尼龙或硝酸纤维素滤膜上用探针进行 Southern 杂交予以确证。