用甲酰胺从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA实验
原理可用甲酰胺代替 SDS/蛋白酶 K 将纯化的噬菌体颗粒去除外壳。这种方法虽然不是很有效，但在某种意义上它比以前的操作方法更快。材料与仪器限制性内切核酸酶 λ
原理
可用甲酰胺代替 SDS/蛋白酶 K 将纯化的噬菌体颗粒去除外壳。这种方法虽然不是很有效，但在某种意义上它比以前的操作方法更快。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 λ 噬菌体颗粒
EDTA 乙醇 甲酰胺 NaCl TE Tris-Cl
琼脂糖凝胶 硼硅酸盐巴斯德吸管
EDTA 乙醇 甲酰胺 NaCl TE Tris-Cl
琼脂糖凝胶 硼硅酸盐巴斯德吸管
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
甲酰胺，去离子
NaCl ( 5 mol/L)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
Tris-Cl ( 2 mol/L，pH 8.5)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 专用设备
硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 钩
5. 载体和菌株
λ 噬菌体颗粒
二、方法
1. 如果必要，按方案 11 步骤 1~4 所述将 CsCl 从噬菌体颗粒样品中除去。
2. 测定噬菌体颗粒样品的体积。
3. 加入 0.1 倍体积的 2 mol/L Tris ( pH 8.5)、0.05 倍体积的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）和 1 倍体积的去离子甲酰胺，37℃ 温育 30 min。
在温育过程中，牛奶状的噬菌体颗粒悬浮液变清成透明溶液。
4. 加入 1 倍体积（等于步骤 3 中的终体积）的 H2O 和 6 倍体积（每倍体积等于步骤 3 中的终体积）的乙醇。
5. 将 λ 噬菌体 DNA 沉淀黏附于封口的硼硅酸盐巴斯德吸管或 Shepherd 钩的末端，转移至含 70% 乙醇的微量离心管中。
6. 短暂离心（10 s ) 收集 DNA 沉淀。
避免长时间的离心，否则将使 DNA 太紧密而难以溶解。
7. 去上清，将离心管打开于实验台放置数分钟以便使乙酵挥发。加入 300 μl TE，通过拍离心管壁使潮湿的 DNA 沉淀重新溶解。尽量避免使用涡旋振荡。
8. 加入 6 μl 5 mol/L NaCl 和 750 μl 乙醇重新沉淀 DNA，收集沉淀，如步骤 6 和 7 所述重新溶解。
9. 采用适当大小的分子质量标准，经 0.7% 琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分 DNA（0.5 μg），检査噬菌体 DNA 的完整性。
10. 将噬菌体 DNA 于 4℃ 保存。
1. 缓冲液和溶液
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
甲酰胺，去离子
NaCl ( 5 mol/L)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
Tris-Cl ( 2 mol/L，pH 8.5)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 专用设备
硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 钩
5. 载体和菌株
λ 噬菌体颗粒
二、方法
1. 如果必要，按方案 11 步骤 1~4 所述将 CsCl 从噬菌体颗粒样品中除去。
2. 测定噬菌体颗粒样品的体积。
3. 加入 0.1 倍体积的 2 mol/L Tris ( pH 8.5)、0.05 倍体积的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）和 1 倍体积的去离子甲酰胺，37℃ 温育 30 min。
在温育过程中，牛奶状的噬菌体颗粒悬浮液变清成透明溶液。
4. 加入 1 倍体积（等于步骤 3 中的终体积）的 H2O 和 6 倍体积（每倍体积等于步骤 3 中的终体积）的乙醇。
5. 将 λ 噬菌体 DNA 沉淀黏附于封口的硼硅酸盐巴斯德吸管或 Shepherd 钩的末端，转移至含 70% 乙醇的微量离心管中。
6. 短暂离心（10 s ) 收集 DNA 沉淀。
避免长时间的离心，否则将使 DNA 太紧密而难以溶解。
7. 去上清，将离心管打开于实验台放置数分钟以便使乙酵挥发。加入 300 μl TE，通过拍离心管壁使潮湿的 DNA 沉淀重新溶解。尽量避免使用涡旋振荡。
8. 加入 6 μl 5 mol/L NaCl 和 750 μl 乙醇重新沉淀 DNA，收集沉淀，如步骤 6 和 7 所述重新溶解。
9. 采用适当大小的分子质量标准，经 0.7% 琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分 DNA（0.5 μg），检査噬菌体 DNA 的完整性。
10. 将噬菌体 DNA 于 4℃ 保存。
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