Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > DNA实验

DNA实验

经双限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验

2024-05-21 DNA实验 加入收藏
原理置换型载体(如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位点,它们在中央


原理

置换型载体(如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位点,它们在中央填充片段的两端以相反方向排列(Frischaufet al. 1983)。

材料与仪器

噬菌体 T4 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶 λ 噬菌体包装混合物
ATP 氯仿 乙醇 酚:氯仿 乙酸钠 焦糖凝胶上样缓冲液
琼脂糖凝胶

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP ( 10 mmol/L)

氯仿

乙醇

酚:氯仿(1:1,V/V)

乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

蔗糖凝胶上样缓冲液

TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

2. 酶和缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶(0.7%),用 0.5X TBE,含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

4. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体(置换型载体)DNA

5. 专用设备

预置于 68℃ 的水浴

6. 载体和菌株

λ 噬菌体包装混合物

二、方法

1. 将从置换型载体中纯化的 25~50 μg λ 噬菌体 DNA 与 TE ( pH 8.0 ) 混合至终体积为 170 μl。

2. 加入 20 μl 两者中任一适宜的 10X 限制酶缓冲液。取两份未消化的 λ 噬菌体 DNA,每份含 0.2 μg,置于冰浴保存。

3. 加入 4 倍过量(100~200 单位)的两者中任一适宜限制酶,按厂家推荐的温度消化 4 h。

4. 将反应于冰浴冷却至 0℃。再取出两个 0.2 μg 的组分,将其中之一(另一份保存至步骤 10 中分析)与另一份未经消化的 DNA ( 步骤 2 ) 于 68℃ 温育 10 min,以打断噬菌体 DNA 黏性末端。加小量(10 μl ) 蔗糖凝胶上样缓冲液,立刻将样品加入至 0.7% 的琼脂糖凝胶中。

5. 用酚: 氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化 DNA。

6. 用标准的乙醇沉淀回收 DNA。



7. 将 DNA 重溶于 TE ( pH 8.0) 中,浓度为 250 μg/ml。加入适宜的 10X 限制酶缓冲液,用第二种限制酶消化,同样为 4 倍过量的酶反应 4 h。

8. 用酚: 氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化 DNA,用标准的乙醇沉淀回收 DNA。

9. 将 DNA 重溶于 TE ( pH 7.6 ) 中,浓度为 300~500 μg/ml,取一组分(0.2 μg)保存于 -20℃。

10. 为了检测消化过程的有效性,用只经第一种酶消化的 0.2 μg 载体(步骤 4 中预留的组分)和最后制成的 0.2 μg 载体(步骤 9 ) 进行预连接反应。从每个连接混合物中取等量(0.1 μg)的 DNA 进行包装,对获得的噬菌体颗粒测定其滴度。

(1) 用水将 DNA 溶液的体积调整至 17 μl。

(2) 加入 2 μl 10X 连接缓冲液,如果必要,再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。

有些商品化连接缓冲液中含有 ATP。如果用这样的缓冲液,就不再需要另加 ATP。

(3) 取 10 μl 步骤 (2) 中制成的混合物,冰浴保存。

(4) 在剩余的混合物(步骤(2) ) 中,加入 0.2~0.5 weiss 单位的 T4 DNA 连接酶,16℃ 温育 2 h。

(5) 用一商品化的 λ 噬菌体包装反应将 0.1 μg 的连接和未连接样品以及 0.1 μg 的未消化载体 DNA 进行包装。


文章底部广告位

文章评论

加载中~