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DNA实验

总 DNA 质量检测及酶切实验

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
原理在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下


原理

在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

材料与仪器

水稻DNA BAC克隆DNA
琼脂糖 限制性内切酶DraI EcoRI EcoRV HindIII 凝胶
水浴锅琼脂糖电泳仪

步骤

1. 取10 μl DNA于0.8% 凝胶检测;

2. 将DNA调节浓度至300-400 ng/
μl ;

3. 仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度(10U-50 U/
μl)厂家配套试剂;

4. 计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:(0.5 ml tube中)
DNA(3-5 mM) 10 
μl
buffer reaction ´10 1.5 μl
Enzyme (15 U/μl) 0.8 μl(冰上)
ddH2O 2.7 
μl
混匀,短暂离心;

5. 37 ℃ 温浴1-2 hrs (纯DNA) 或10 hrs(粗制DNA);

6. 加入上样缓冲液终止酶切反应,也可65 ℃加热10 min使酶变性失活;

7. 电泳检测酶切效率:
每个样品取1/10量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。

注意事项


1.酶解不一定要过夜,不过反应时间越长所用的酶量就越少。与用酶解鉴定载体/插


入片段相比,酶解基因组DNA所用酶浓度要高一些,一般1μg基因组DNA需加入5U内切酶。


2.若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多,表明酶切不完全。这可能是因为:①反应时间不够长(若反应过夜则可排除此项);②酶量不够或酶部分失活;③如果初始DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时,TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应,这时可以用乙醇重新沉淀DNA,然后溶于少量TE缓冲液或SWD中。


3.选用的DNA相对分子质量其涵盖的相对分子质量范围要大,如λHindⅢ可涵盖500bp到23kb的范围。


4.DNA样品经消化后在各泳道中条带的亮度应一致,否则表明各样品浓度不一致。DNA浓度通常难以精确测定,可以通过调节上样体积来调节DNA的上样量。


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