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DNA实验

大小排阻层析法纯化放射性标记的寡核苷酸实验

2024-06-01 DNA实验 加入收藏
材料与仪器氯仿 EDTA 乙醇 酚:氯仿 乙酸钠 TE Tris-Cl Tris-SDS 层析缓冲液 放射性标记的寡核苷酸 纯化的原料凝胶过滤树脂 破璃棉 巴斯


材料与仪器

氯仿 EDTA 乙醇 酚:氯仿 乙酸钠 TE Tris-Cl Tris-SDS 层析缓冲液 放射性标记的寡核苷酸 纯化的原料
凝胶过滤树脂 破璃棉 巴斯德吸管

步骤

材料

溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。

氯仿
任选,见步驟 7。

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

酚:氯仿
任选,见步骤 7。

乙酸钠(3mol/L,pH5.2)
任选,见步驟 7。

TE(pH7.6)

Tris-Cl(1mol/L pH8.0)
任选,见步骤 7。

Tris-SDS 层析缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
0.1%(m/V)SDS

核酸和寡核苷酸

放射性标记的寡核苷酸

纯化的原料为方案 2(步驟 3 或步骤 5) 的反应混合液,T4 噬菌体多核苷酸激酶已在 68°C 灭活。

专用设备

凝胶过滤树脂(Bio-Gel P-60 fine-grade 或 Sephadex G-15)
Bio-Gel P-60(精细级)可以从 Bio-Rad 公司购买,大多数化学试剂供应商可提供 Sephadex G-15(如 Sigma 公司)。Bio-GelP-60 是預胀后产品,而 Sephadex G-15 则必须在使用前膨胀及平衡。

破璃棉
用铝箔包裹少置的玻璃棉,按包裹物的灭菌程序在 15psi(1.05 kg/cm2) 下高压灭菌微量离心管(1.5 ml) 放于管架或收集器用于收集放射性标记的寡核苷酸层析洗脱液。

巴斯德吸管

附加试剂

步骤 6 需要的试剂列于第 13 章的方案 7。

方法

1. 有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入 30ul 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液。在准备大小排阻树脂时,将样品保存于 0°C。
为方便起见,本方案以 Bio-GelP-60 树脂为例,亦可同样有效地应用于 SepbadexG-15。

2. 用消毒巴斯德管制备 Bio-GelP-60 层析柱。

a. 用 10 倍体积的 Tris-SDS 层析缓冲液平衡厂家提供的 Bio-Gel P-60 树脂。
如果有离心蒸发器(Savant SpeedVac 或类似设备), 可以用 0.1% 的碳酸氢铵溶液装 Bio-Gel P-60 层析柱及冲洗,收集的含放射性标记的寡核苷酸组分可以用离心蒸发器干燥(步骤 6), 而不须用有机溶剂抽提或乙醇沉淀寡核苷酸。

b. 将一团灭菌后的玻璃棉塞入消毒的巴斯德吸管底部。
玻璃毛细管亦可作为很好的填塞工具。.

c. 准备好层析管后,倒入少量 Tris-SDS 层析缓冲液,检查缓冲液流速(以数秒一滴为宜)。

d. 将 Bio-GelP-60 树脂浆倒入层析管。树脂随重力下沉,缓冲液流出,柱身迅速形成。再加入树脂浆,使玻璃棉塞至吸管顶端附近的缢痕处完全被充填。

e. 用 3 mlTris-SDS 层析缓冲液冲洗柱子。
重要勿让层析管流干。必要时用封口膜封住管底。

3. 用吸管吸去树脂上端多余的缓冲液,然后迅速将放射性标记的寡核苷酸加到树脂上
(体积 100ul 或稍小)。

4. 样品进入层析树脂后,立即加入 100ul 缓冲液,待缓冲液进入树脂后,即刻连续补充新的缓冲液,不要让层析柱流干。

5. 用手提式微型探测仪检测放射性标记寡核苷酸的流动。待流出液开始出现放射性时, 用微量离心管收集两滴液体。
警惕:磷酸化反应常常使用大于 100uCi 放射性标记的 ATP, 因此上清中放射性剂量相当可观,应小心、谨慎处理未掺入的放射性标记物、移液器吸头及微量离心管。

6. 当放射性液体接近全部流出时,用液闪仪测量各组分的切伦克夫计数(见附录 8)。如果快速移动的洗脱峰(放射性标记的寡核苷酸)与移动较慢的未掺入的 [γ-32P]ATP 能明显分离,可以合并所有含放射性标记寡核苷酸的组分。如果各峰分离不明显,即取每一组分各约 0.5ul,用测定结合于 DE-81 滤膜放射性(详细方法可参阅第 13 章的方案 7 中步骤 3) 或薄层层析方法分析。再合并不含未掺入放射性 [γ-32P] 的放射性标记寡核苷敢组分。

7. 如放射性标记的寡核苷酸用于酶促反应,应进行下列步骤。否则,进行步骤 8。

a. 用等体积酚-氯仿抽提合并的标记寡核苷酸组分。

b. 用 50ul10 mml/LTris-Cl(pH8.0) 反向抽提有机相,并合并两次的水相。

c. 用等体积氯仿抽提合并的水相。

d. 加入 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠(pH5.2), 简单混旋,再加 3 倍体积的乙醇,0°C 放置 30 min。4°C 下以最大转速离心 20 min 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇(放射性含量很低)。

8. 在离心管中加入 500ul80% 的乙醇,稍加振荡,再以最大转速离心 5 min。

9. 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇。将离心管打开管口,放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后,直到剩余的乙醇挥发干净。

10. 用 20ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸,于-20°C 保存。


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