大小排阻层析法纯化放射性标记的寡核苷酸实验
材料与仪器氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 乙酸钠 TE Tris-Cl Tris-SDS 层析缓冲液 放射性标记的寡核苷酸 纯化的原料凝胶过滤树脂 破璃棉 巴斯
材料与仪器
氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 乙酸钠 TE Tris-Cl Tris-SDS 层析缓冲液 放射性标记的寡核苷酸 纯化的原料
凝胶过滤树脂 破璃棉 巴斯德吸管
凝胶过滤树脂 破璃棉 巴斯德吸管
步骤
材料
溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。
氯仿
任选，见步驟 7。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿
任选，见步骤 7。
乙酸钠（3mol/L,pH5.2）
任选，见步驟 7。
TE(pH7.6)
Tris-Cl(1mol/L pH8.0)
任选，见步骤 7。
Tris-SDS 层析缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
0.1%(m/V)SDS
核酸和寡核苷酸
放射性标记的寡核苷酸
纯化的原料为方案 2(步驟 3 或步骤 5) 的反应混合液，T4 噬菌体多核苷酸激酶已在 68°C 灭活。
专用设备
凝胶过滤树脂（Bio-Gel P-60 fine-grade 或 Sephadex G-15)
Bio-Gel P-60(精细级）可以从 Bio-Rad 公司购买，大多数化学试剂供应商可提供 Sephadex G-15(如 Sigma 公司）。Bio-GelP-60 是預胀后产品，而 Sephadex G-15 则必须在使用前膨胀及平衡。
破璃棉
用铝箔包裹少置的玻璃棉，按包裹物的灭菌程序在 15psi(1.05 kg/cm2) 下高压灭菌微量离心管（1.5 ml) 放于管架或收集器用于收集放射性标记的寡核苷酸层析洗脱液。
巴斯德吸管
附加试剂
步骤 6 需要的试剂列于第 13 章的方案 7。
方法
1. 有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入 30ul 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液。在准备大小排阻树脂时，将样品保存于 0°C。
为方便起见，本方案以 Bio-GelP-60 树脂为例，亦可同样有效地应用于 SepbadexG-15。
2. 用消毒巴斯德管制备 Bio-GelP-60 层析柱。
a. 用 10 倍体积的 Tris-SDS 层析缓冲液平衡厂家提供的 Bio-Gel P-60 树脂。
如果有离心蒸发器（Savant SpeedVac 或类似设备）, 可以用 0.1% 的碳酸氢铵溶液装 Bio-Gel P-60 层析柱及冲洗，收集的含放射性标记的寡核苷酸组分可以用离心蒸发器干燥（步骤 6), 而不须用有机溶剂抽提或乙醇沉淀寡核苷酸。
b. 将一团灭菌后的玻璃棉塞入消毒的巴斯德吸管底部。
玻璃毛细管亦可作为很好的填塞工具。.
c. 准备好层析管后，倒入少量 Tris-SDS 层析缓冲液，检查缓冲液流速（以数秒一滴为宜)。
d. 将 Bio-GelP-60 树脂浆倒入层析管。树脂随重力下沉，缓冲液流出，柱身迅速形成。再加入树脂浆，使玻璃棉塞至吸管顶端附近的缢痕处完全被充填。
e. 用 3 mlTris-SDS 层析缓冲液冲洗柱子。
重要勿让层析管流干。必要时用封口膜封住管底。
3. 用吸管吸去树脂上端多余的缓冲液，然后迅速将放射性标记的寡核苷酸加到树脂上
(体积 100ul 或稍小）。
4. 样品进入层析树脂后，立即加入 100ul 缓冲液，待缓冲液进入树脂后，即刻连续补充新的缓冲液，不要让层析柱流干。
5. 用手提式微型探测仪检测放射性标记寡核苷酸的流动。待流出液开始出现放射性时, 用微量离心管收集两滴液体。
警惕：磷酸化反应常常使用大于 100uCi 放射性标记的 ATP, 因此上清中放射性剂量相当可观，应小心、谨慎处理未掺入的放射性标记物、移液器吸头及微量离心管。
6. 当放射性液体接近全部流出时，用液闪仪测量各组分的切伦克夫计数（见附录 8）。如果快速移动的洗脱峰（放射性标记的寡核苷酸）与移动较慢的未掺入的 [γ-32P]ATP 能明显分离，可以合并所有含放射性标记寡核苷酸的组分。如果各峰分离不明显，即取每一组分各约 0.5ul，用测定结合于 DE-81 滤膜放射性（详细方法可参阅第 13 章的方案 7 中步骤 3) 或薄层层析方法分析。再合并不含未掺入放射性 [γ-32P] 的放射性标记寡核苷敢组分。
7. 如放射性标记的寡核苷酸用于酶促反应，应进行下列步骤。否则，进行步骤 8。
a. 用等体积酚-氯仿抽提合并的标记寡核苷酸组分。
b. 用 50ul10 mml/LTris-Cl(pH8.0) 反向抽提有机相，并合并两次的水相。
c. 用等体积氯仿抽提合并的水相。
d. 加入 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠（pH5.2), 简单混旋，再加 3 倍体积的乙醇，0°C 放置 30 min。4°C 下以最大转速离心 20 min 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇（放射性含量很低)。
8. 在离心管中加入 500ul80% 的乙醇，稍加振荡，再以最大转速离心 5 min。
9. 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇。将离心管打开管口，放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后，直到剩余的乙醇挥发干净。
10. 用 20ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸，于-20°C 保存。
溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。
氯仿
任选，见步驟 7。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿
任选，见步骤 7。
乙酸钠（3mol/L,pH5.2）
任选，见步驟 7。
TE(pH7.6)
Tris-Cl(1mol/L pH8.0)
任选，见步骤 7。
Tris-SDS 层析缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
0.1%(m/V)SDS
核酸和寡核苷酸
放射性标记的寡核苷酸
纯化的原料为方案 2(步驟 3 或步骤 5) 的反应混合液，T4 噬菌体多核苷酸激酶已在 68°C 灭活。
专用设备
凝胶过滤树脂（Bio-Gel P-60 fine-grade 或 Sephadex G-15)
Bio-Gel P-60(精细级）可以从 Bio-Rad 公司购买，大多数化学试剂供应商可提供 Sephadex G-15(如 Sigma 公司）。Bio-GelP-60 是預胀后产品，而 Sephadex G-15 则必须在使用前膨胀及平衡。
破璃棉
用铝箔包裹少置的玻璃棉，按包裹物的灭菌程序在 15psi(1.05 kg/cm2) 下高压灭菌微量离心管（1.5 ml) 放于管架或收集器用于收集放射性标记的寡核苷酸层析洗脱液。
巴斯德吸管
附加试剂
步骤 6 需要的试剂列于第 13 章的方案 7。
方法
1. 有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入 30ul 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液。在准备大小排阻树脂时，将样品保存于 0°C。
为方便起见，本方案以 Bio-GelP-60 树脂为例，亦可同样有效地应用于 SepbadexG-15。
2. 用消毒巴斯德管制备 Bio-GelP-60 层析柱。
a. 用 10 倍体积的 Tris-SDS 层析缓冲液平衡厂家提供的 Bio-Gel P-60 树脂。
如果有离心蒸发器（Savant SpeedVac 或类似设备）, 可以用 0.1% 的碳酸氢铵溶液装 Bio-Gel P-60 层析柱及冲洗，收集的含放射性标记的寡核苷酸组分可以用离心蒸发器干燥（步骤 6), 而不须用有机溶剂抽提或乙醇沉淀寡核苷酸。
b. 将一团灭菌后的玻璃棉塞入消毒的巴斯德吸管底部。
玻璃毛细管亦可作为很好的填塞工具。.
c. 准备好层析管后，倒入少量 Tris-SDS 层析缓冲液，检查缓冲液流速（以数秒一滴为宜)。
d. 将 Bio-GelP-60 树脂浆倒入层析管。树脂随重力下沉，缓冲液流出，柱身迅速形成。再加入树脂浆，使玻璃棉塞至吸管顶端附近的缢痕处完全被充填。
e. 用 3 mlTris-SDS 层析缓冲液冲洗柱子。
重要勿让层析管流干。必要时用封口膜封住管底。
3. 用吸管吸去树脂上端多余的缓冲液，然后迅速将放射性标记的寡核苷酸加到树脂上
(体积 100ul 或稍小）。
4. 样品进入层析树脂后，立即加入 100ul 缓冲液，待缓冲液进入树脂后，即刻连续补充新的缓冲液，不要让层析柱流干。
5. 用手提式微型探测仪检测放射性标记寡核苷酸的流动。待流出液开始出现放射性时, 用微量离心管收集两滴液体。
警惕：磷酸化反应常常使用大于 100uCi 放射性标记的 ATP, 因此上清中放射性剂量相当可观，应小心、谨慎处理未掺入的放射性标记物、移液器吸头及微量离心管。
6. 当放射性液体接近全部流出时，用液闪仪测量各组分的切伦克夫计数（见附录 8）。如果快速移动的洗脱峰（放射性标记的寡核苷酸）与移动较慢的未掺入的 [γ-32P]ATP 能明显分离，可以合并所有含放射性标记寡核苷酸的组分。如果各峰分离不明显，即取每一组分各约 0.5ul，用测定结合于 DE-81 滤膜放射性（详细方法可参阅第 13 章的方案 7 中步骤 3) 或薄层层析方法分析。再合并不含未掺入放射性 [γ-32P] 的放射性标记寡核苷敢组分。
7. 如放射性标记的寡核苷酸用于酶促反应，应进行下列步骤。否则，进行步骤 8。
a. 用等体积酚-氯仿抽提合并的标记寡核苷酸组分。
b. 用 50ul10 mml/LTris-Cl(pH8.0) 反向抽提有机相，并合并两次的水相。
c. 用等体积氯仿抽提合并的水相。
d. 加入 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠（pH5.2), 简单混旋，再加 3 倍体积的乙醇，0°C 放置 30 min。4°C 下以最大转速离心 20 min 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇（放射性含量很低)。
8. 在离心管中加入 500ul80% 的乙醇，稍加振荡，再以最大转速离心 5 min。
9. 用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇。将离心管打开管口，放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后，直到剩余的乙醇挥发干净。
10. 用 20ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸，于-20°C 保存。
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