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DNA实验

BAC文库的构建

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
原理BAC是一种装载DNA大片段的克隆载体系统,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片段较大(几千个碱基至350kb)、嵌合率低、遗传稳定性好、易于


原理

BAC是一种装载DNA大片段的克隆载体系统,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片段较大(几千个碱基至350kb)、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组研究的重要基础,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要功能基因的定位克隆、基因结构及功能分析。

材料与仪器

EcoRⅠ消化的基因组DNA 载体DNA 电转化感受态细菌细胞
5 X 缓冲液 EDTA 蛋白水解酶K PMSF 缓冲液 Not I 限制酶和缓冲液 琼脂糖溶液 0.5 X TBE 缓冲液
SOC 培养基 LB 平板 LB 培养基 水浴锅 激孔透析膜 离心管 轨道混合器 自动质粒隔离系统 软质塑料96孔板

步骤

1.目标区域的大小


(1)如果基因组的目标区域很小(小于50kb),那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株,研究者可以方便的构建黏粒载体文库。


(2)如果基因组的目标区域比较大,那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难,PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择,研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库,比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。


(3)如果目标区域非常大(大于250kb),那么YAC载体就是首选了。不过,应用YAC载体来构建基因组文库,操作非常繁琐困难,一般由专门的公司来完成。


2.筛选文库的难易程度


黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选,但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库,如P1、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存,既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选,又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且,使用高容量载体构建文库,可以减少染色体步查的步骤。


3. 载体拷贝数的考虑


当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时,克隆DNA会发生重组,从而影响克隆序列的保真性和稳定性;而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。而EPICENTRE's CopyControlTM 克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性,而且拷贝载体能在诱导剂的作用下,即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。


四、将基因组DNA片段连接入载体


使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。商业化载体已经经过预处理,可以直接使用,无需内切酶消化及脱磷酸化处理。连接反应体系以100ul为宜。


注意:BAC载体连接完以后,需要将连接产物做脱盐处理,除去连接反应缓冲液里的盐分。


五、将重组载体转入宿主细胞


1. 如果使用Epicentre试剂盒构建黏粒文库,需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物,测定包装好的黏粒克隆的滴度,然后转染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重组子,鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选,或者扩增、保存文库。


2. 如果使用Epicentre试剂盒构建BAC文库,应选择电转法,可以选择Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作为宿主,将上述连接产物转入细菌,涂板长出克隆后。获得克隆,研究者需要对BAC克隆的大小进行评估,确定文库大小是否能够满足要求。Epicentre 文库构建试剂盒中的EPILyse和EPIBlue,快速裂解克隆并电泳,可以方便的鉴定出BAC克隆的大小,从而估计出BAC文库的大小。如果文库大小合适,那么这个文库就可以进行后续的操作了。


六、文库克隆数的确定


基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定:


N = ln (1-P ) / ln (1-f )


P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数。


举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为:


N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x10-6= 138,298


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