通过免疫共沉淀确定结合蛋白实验
材料与仪器培养基中生长的适宜细胞株乙腈 考马斯亮蓝 R-250 EBC 裂解缓冲液 NETN 磷酸盐缓冲溶液 SDS 凝胶加样缓冲液 三氟乙酸 胰蛋白酶 胰蛋白
材料与仪器
培养基中生长的适宜细胞株
乙腈 考马斯亮蓝 R-250 EBC 裂解缓冲液 NETN 磷酸盐缓冲溶液 SDS 凝胶加样缓冲液 三氟乙酸 胰蛋白酶 胰蛋白酶消化缓冲液 沉淀靶蛋白的抗体 对照抗体 不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
沸水浴 蛋白质 A-Sepharose 平板摇台
乙腈 考马斯亮蓝 R-250 EBC 裂解缓冲液 NETN 磷酸盐缓冲溶液 SDS 凝胶加样缓冲液 三氟乙酸 胰蛋白酶 胰蛋白酶消化缓冲液 沉淀靶蛋白的抗体 对照抗体 不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
沸水浴 蛋白质 A-Sepharose 平板摇台
步骤
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到适当浓度
乙腈（50%)
考马斯亮蓝 R-250
EBC 裂解缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
120 mmol/L NaCl
0.5%(V/V) Nonidet P-40
5ug/ml 白胃素
10ug/ml 抑肽酶
50ug/ml PMSF
0.2 mmol/L 正钒酸纳
100 mmol/L 氯化纳
NETN
20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
100 mmol/L 氯化钠
0.5%Nonidet P-40
NETN, 含 900 mmol/LNaCl
磷酸盐缓冲溶液
1xSDS 凝胶加样缓冲液
三氟乙酸（TFA)(0.1%，m/V， 测序级）
酶及缓冲液
胰蛋白酶
在 200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)(测序级，Boehringer Mannheim 公司）溶液中制备 250ug/ml 的牛胰蛋白酶
胰蛋白酶消化缓冲液
0.02%(V/V) 吐溫-20
200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)
抗体
沉淀靶蛋白的抗体
对照抗体
凝胶
不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
分离胶（pH8.8 的 7.5%~15% 不连续胶）应为 20~30 cm 长，浓缩胶（pH6.8 的 5% 胶）应为 10 cm 长，孔本身应为 1~2 cm 深（胶的百分浓度会随目的蛋白而有所不同）。倒浓缩胶时不用多孔梳子，通过在玻璃板间垂直插入垫片来制作加样孔，这样可以形成足够大的加样孔。关于 SDS-PAGE 的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
蛋白质 A-Sepharose
在 NETN 缓冲液中制备 1:1 悬浮的蛋白质 A-Sepharose
平板摇台
附加试剂
此方案的步骤 10 和 11 需要肽谱分析、肽纯化和测序的试剂和仪器（请见 Spector et al.1998,62 和 63 章）
细胞和组织
培养基中生长的适宜细胞株
方法
重要：这一方案是用于确定 pVHL 结合蛋白。对目标蛋白应当进行条件优化。
1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞（总共约 6X107 个细胞)。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4°C 以最大速度离心 15 min。
3. 收集上清（约 30 ml) 并加入 30ug 的适当抗体，4°C 摇动免疫沉淀物 1h。
4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4°C 再摇动免疫沉淀物 30 min。
5. 用含 0.9 mmol/LNaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。
6. 吸出混合物的液体部分。加入 800ul 的 1XSDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min。
7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10mA 的恒定电流下电泳过夜。
8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带（附录 8)。
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
a. 将胶条移到一个清洁的表面，让它不完全干。
b. 加 5ul 胰蛋白酶消化缓冲液和 2ul 胰蛋白酶溶液。
c. 在胶吸附胰蛋白酶溶液后，每次加 5ul 的胰蛋白酶缓冲液，直到胶条恢复到最初的大小。
d. 将胶条置于微量离心管中，浸泡在胰蛋白酶消化缓冲液中并在 30°C 孵育 4 h。加入 1.5ul 的 0.1% 三氟乙酸终止反应。
蛋白质的观察和消化步骤变化很大。事实上，蛋白质还在聚丙烯酰胺凝胶中时，或蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 胰上后，都可进行消化。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
供序或 Edman 分析的样品处理也有变化，最好与操作仪器的人讨论。对方法的评述，请见 Matsudaira(1993)、Link(1999) 及 Spector 等（1998, 第 62 和 63 章）的文献。
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到适当浓度
乙腈（50%)
考马斯亮蓝 R-250
EBC 裂解缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
120 mmol/L NaCl
0.5%(V/V) Nonidet P-40
5ug/ml 白胃素
10ug/ml 抑肽酶
50ug/ml PMSF
0.2 mmol/L 正钒酸纳
100 mmol/L 氯化纳
NETN
20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
100 mmol/L 氯化钠
0.5%Nonidet P-40
NETN, 含 900 mmol/LNaCl
磷酸盐缓冲溶液
1xSDS 凝胶加样缓冲液
三氟乙酸（TFA)(0.1%，m/V， 测序级）
酶及缓冲液
胰蛋白酶
在 200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)(测序级，Boehringer Mannheim 公司）溶液中制备 250ug/ml 的牛胰蛋白酶
胰蛋白酶消化缓冲液
0.02%(V/V) 吐溫-20
200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)
抗体
沉淀靶蛋白的抗体
对照抗体
凝胶
不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
分离胶（pH8.8 的 7.5%~15% 不连续胶）应为 20~30 cm 长，浓缩胶（pH6.8 的 5% 胶）应为 10 cm 长，孔本身应为 1~2 cm 深（胶的百分浓度会随目的蛋白而有所不同）。倒浓缩胶时不用多孔梳子，通过在玻璃板间垂直插入垫片来制作加样孔，这样可以形成足够大的加样孔。关于 SDS-PAGE 的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
蛋白质 A-Sepharose
在 NETN 缓冲液中制备 1:1 悬浮的蛋白质 A-Sepharose
平板摇台
附加试剂
此方案的步骤 10 和 11 需要肽谱分析、肽纯化和测序的试剂和仪器（请见 Spector et al.1998,62 和 63 章）
细胞和组织
培养基中生长的适宜细胞株
方法
重要：这一方案是用于确定 pVHL 结合蛋白。对目标蛋白应当进行条件优化。
1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞（总共约 6X107 个细胞)。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4°C 以最大速度离心 15 min。
3. 收集上清（约 30 ml) 并加入 30ug 的适当抗体，4°C 摇动免疫沉淀物 1h。
4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4°C 再摇动免疫沉淀物 30 min。
5. 用含 0.9 mmol/LNaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。
6. 吸出混合物的液体部分。加入 800ul 的 1XSDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min。
7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10mA 的恒定电流下电泳过夜。
8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带（附录 8)。
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
a. 将胶条移到一个清洁的表面，让它不完全干。
b. 加 5ul 胰蛋白酶消化缓冲液和 2ul 胰蛋白酶溶液。
c. 在胶吸附胰蛋白酶溶液后，每次加 5ul 的胰蛋白酶缓冲液，直到胶条恢复到最初的大小。
d. 将胶条置于微量离心管中，浸泡在胰蛋白酶消化缓冲液中并在 30°C 孵育 4 h。加入 1.5ul 的 0.1% 三氟乙酸终止反应。
蛋白质的观察和消化步骤变化很大。事实上，蛋白质还在聚丙烯酰胺凝胶中时，或蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 胰上后，都可进行消化。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
供序或 Edman 分析的样品处理也有变化，最好与操作仪器的人讨论。对方法的评述，请见 Matsudaira(1993)、Link(1999) 及 Spector 等（1998, 第 62 和 63 章）的文献。
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