P1 噬菌体克隆在大肠杆菌宿主间的转移

从不同大肠杆菌菌株中获得的 P1 噬菌体 DNA 的产量与质量取决于宿主菌的基因型和重组子中外源 DNA 的特定序列。将 P1 或 PAC 重组子转化到不表达 Cre 重组酶的大肠杆菌菌株中有时可以解决低产或劣质的问题（如 NS3516; Sternberg et al. 1994)。

限制性内切核酸酶 闭环重组 P1 DNA 电转感受态大肠杆菌细胞
琼脂糖凝胶 LB 琼脂平板 SOC 培养基 电穿孔仪

一、材料

1. 酶与缓冲液

限制性内切核酸酶

2. 凝胶

琼脂糖凝胶

3. 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板

SOC 培养基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养基

4. 专用设备

电穿孔仪

5. 载体和菌株

闭环重组 P1 DNA

冷冻保存的电转感受态大肠杆菌细胞（如 DH10B )

二、方法

1. 用无菌水将 2~3 μg P1 质粒 DNA 稀释至 60 ng/μl。设一不含 P1 DNA 的对照样品 (无菌水)，在电穿孔时作为平行对照。.

2. 将电转感受态细胞置于冰上融化。预冷 0.1 cm 电穿孔杯。

3. 将 20 μl 细胞与 1 μl P1 DNA 在预冷的电穿孔杯中混合。

4. 将电穿孔仪设为 1.8 kV, 200 Ω，25 μF。

5. 电击细胞，最佳时间常数通常约为 5 ms。

6. 立即向细胞悬液中加入 0.5 ml 预热至 37℃ 的 SOC 培养基。将悬液转移至一培养管中，37℃ 中度振荡培养 1 h。

7. 将 100 μl 的细胞悬液涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板上，37℃ 温育过夜。

8. 将 10~12 个菌落分别置于 11 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培养液中。37℃ 剧烈振荡，培养过夜。

9. 制备 P1 DNA。

10. 用不同限制性内切核酸酶进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳比较新提取的 DNA 与原始重组子 DNA 的酶切图谱。